慢性心力衰竭(CHF)是各种器质性心脏疾患的终末阶段，5年存活率和恶性肿瘤类似[1]。在中国34～74岁年龄段的人群，就有超过400万的心力衰竭患者，年病死率高达40%[2]。心肌纤维化是CHF的重要特征之一，而转化生长因子β1(TGFβ1)是最近几年发现的与心肌纤维化、CHF密切相关的细胞因子[3]。黄芪甲苷是中药黄芪制剂中的主要活性成分，同时黄芪甲苷的含量作为黄芪制剂的质量控制标准。黄芪甲苷具有免疫调节、抗炎、抗氧化、保护血管内皮等多效性的作用，本研究采用黄芪甲苷干预CHF大鼠模型，观察其对心肌纤维化、心功能指标等影响，进一步探讨黄芪甲苷的CHF保护作用是否与抑制TGFβ1的表达有关。
材料与方法 一、 材料及动物模型建立SD雄性大鼠110只(山东鲁抗医药股份有限公司提供，生产许可证号：scxk鲁20130001)，体质量280～300 g。按照参考文献[4]制作大鼠模型，术后连续3 d给予腹腔注射青霉素(20万U/只)，常规喂养。假手术组(10只)穿线而不结扎腹主动脉，其余操作参照模型，术后8周100只结扎大鼠存活65只，存活率65%，随机抽取5只大鼠行血流动力学监测，左心室舒张未压(LVEDP)均大于15 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa),提示心力衰竭模型成功建立，剩余60只大鼠平均分为空白组、黄芪甲苷(低、中、高)剂量组(20、40、60 mg/kg)、缬沙坦组，每组12只，黄芪甲苷组以及缬沙坦组术后通过灌胃给予相应剂量药物，连续4周，空白组以及假手术组(全部存活)给予相应剂量的生理盐水。
二、 仪器电子天平(0～1 000 g)；10%水合氯醛；青霉素(80万U/支，山东鲁抗医药提供)。BL-420生物机能实验系统(成都泰盟科技有限公司),全能型ChemiDocMP成像分析系统。黄芪甲苷(纯度＞98%，南京青泽医药科技开发有限公司),缬沙坦胶囊(80 mg/粒，北京诺华公司)，兔抗鼠多克隆抗体TGFβ1、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH,USA,Proteintech)，Masson染色、RT-PCR、SP试剂盒(武汉博士德公司)。
三、 心脏血流动力学指标检测末次给药之后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛(3 ml/kg)进行麻醉，测量大鼠体质量,然后在颈部右侧开约为2 cm的纵向切口，分离皮下组织找到颈总动脉，用组织剪在颈总动脉做一斜行切口，将充满肝素生理盐水的PE-50聚乙烯导管插入，缓慢旋转进管，最终进入左心室腔，另一端接在连有BL-420生物机能实验系统的压力换能器上，记录并分析LVEDP、左心室内压最大上升速率/左心室内压最大下降速率(±dp/dtmax)、左心室收缩压(LVSP)、LVMI等指标。
四、 心脏组织采集待血流动力学指标测量完成后，称量体质量后立即取出心脏，用冰生理盐水洗净血液，滤纸吸干水迹等，称量心脏质量并记录，然后剪取左心室(保留室间隔)，称量左心室质量，计算左室重量/体质量比(LVW/BW，即LVMI)、心脏重量/体质量比(HW/BW)，同时取大约0.5 cm厚的左心室组织置于4%多聚甲醛中用来包埋、切片(5 μm)，以备苏木素-伊红染色、Masson以及免疫组织化学染色，剩余组织放于-80℃中冷藏，用于蛋白免疫印迹法实验。
五、 心肌胶原容积分数(CVF)的测定按照Masson染色试剂盒的说明进行操作，在光学显微镜下进行观察，每只大鼠取4个不含血管的视野进行IPP 6.0图像分析系统处理，计算胶原组织所占面积的百分比，取平均值作为每只大鼠的CVF。
六、 RT-PCR检测心肌组织中TGFβ1 mRNA的表达取上述新鲜组织，用生理盐水灌洗后，按Trizol试剂盒提示方法提取总RNA，按照RT-PCR试剂盒说明进行操作，检查其浓度和纯度后，在PCR 热循环仪中逆转录为cDNA(TGFβ1引物上游5-CCGCAACAACGCAATCTATG-3 下游5-GCCCTGTATTCCGTCTCCTT-3)。PCR 反应程序为: 94 ℃预变性25 s，GAPDH 52 ℃退火30 s，共30个循环，72 ℃延伸30 s，TGFβ1 56℃退火38 s，共35个循环，72 ℃延伸35 s，PCR 产物经2%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。凝胶扫描分析仪计算目的带吸光度值，TGFβ1 mRNA 表达的相对强度= TGFβ1条带灰度值/GAPDH条带灰度值。
七、 心肌组织TGFβ1的表达参照SP试剂盒说明书进行免疫组织化学染色，TGFβ1(体积稀释度1∶ 300)，磷酸盐缓冲液作为阴性对照。阳性表达为棕黄色颗粒。采用图像分析系统进行处理，经过标准灰度值校正，然后随机取每张图片中的5个视野进行积分光密度值的测定，取其平均值作为标本值。在进行蛋白免疫印迹之前，首先提取心肌组织蛋白，并进行蛋白浓度的监测，然后取50 μg蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，并转膜至PVDF膜上，进行脱脂奶粉的封闭处理，TBST洗膜，加入一抗(TGFβ1体积稀释度1∶ 2 000)；GAPDH(体积稀释度1∶ 2 000)，4℃孵育过夜，再次TBST洗膜后加入二抗室温孵育2 h，ECL显色，于全能型ChemiDocMP成像分析系统采集图像，用积分吸光度比值(TGFβ1/GAPDH)作为其相对表达量。
八、 统计学处理采用SPSS 17.0统计学软件。所有的数据均以x±s表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。
结果 一、 各组大鼠一般情况假手术组大鼠表现正常，空白组大鼠皮毛不整，活动后出现憋喘，双下肢出现水肿；各用药物组症状较空白组大鼠轻微，灌胃给药结束后空白组大鼠死亡1只，考虑为慢性心力衰竭急性发作。其余组未见死亡。
二、 各组大鼠血流动力学指标监测与假手术组相比，空白组大鼠中±dp/dtmax显著下降,LVEDP、LVSP明显上升；与空白组相比，黄芪甲苷高、中剂量组LVEDP、LVSP明显下降，+dp/dtmax、-dp/dtmax显著上升，见表 1。
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表 1 大鼠血流动力学指标测定结果(x±s) |
与假手术组相比，空白组大鼠HW/BW、LVW/BW的比值明显升高，黄芪甲苷组相应比值较空白组有所下降，随着的黄芪甲苷剂量的升高，下降的幅度越大，具有明显的剂量依赖性，见图 1。
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图 1 大鼠HW/BW、LVW/BW比值 1:假手术组；2：空白组；3：黄芪甲苷低剂量组；4：黄芪甲苷中剂量组；5：黄芪甲苷高剂量组；6：缬沙坦组；与假手术组相比，*P＜0.01；与空白组相比，＃P＜0.01、＃＃P＜0.05 |
光镜下观察，假手术组中心肌细胞排列整齐、大小匀称、细胞清晰可见。空白组大鼠心肌细胞形态不规则、细胞肥大，胞间存在大量的纤维组织，同时有大量炎性细胞的浸润。黄芪甲苷低、中、高剂量组心肌细胞轻度肥大，细胞排列尚整齐，伴有不同程度的纤维组织的增生，较空白组明显减轻，随着黄芪甲苷的剂量的增加，改善程度增强，见图 2。
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图 2 大鼠心肌组织切片(苏木素-伊红染色，×400) A:假手术组；B：空白组；C：黄芪甲苷低剂量组；D：黄芪甲苷中剂量组；E：黄芪甲苷高剂量组；F：缬沙坦组 |
在Masson染色中，胶原蛋白被染色为蓝色，心肌细胞染色为暗红色，同假手术组比，空白组CVF的比值明显升高，与空白组相比，黄芪甲苷低、中、高剂量组CVF比值明显的下降，见图 3、表 2。
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图 3 大鼠心肌组织切片(Masson染色,×400) A:假手术组；B：空白组；C：黄芪甲苷低剂量组；D：黄芪甲苷中剂量组；E：黄芪甲苷高剂量组；F：缬沙坦组 |
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表 2 大鼠心肌组织CVF、RT-PCR、免疫组织化学和蛋白免疫印迹法结果(x±s) |
TGFβ1主要表达于心肌胞质中，为棕黄色的颗粒，同假手术组相比，空白组中TGFβ1平均积分吸光度值明显增大；同空白组相比，黄芪甲苷低、中、高剂量组中TGFβ1的平均吸光度值显著下降(呈现剂量依赖性)，见图 4、表 2。
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图 4 大鼠心肌组织切片免疫组化TGFβ1表达图(×400) A:假手术组；B：空白组；C：黄芪甲苷低剂量组；D：黄芪甲苷中剂量组；E：黄芪甲苷高剂量组；F：缬沙坦组 |
同假手术组相比，空白组中心肌组织TGFβ1因子表达水平明显增强；同空白组相比较，黄芪甲苷低、中、高剂量组心肌组织TGFβ1因子表达水平明显减弱，见图 5、表 2。
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图 5 各组心肌组织TGFβ1因子的表达 A:假手术组；B：空白组；C：黄芪甲苷低剂量组；D：黄芪甲苷中剂量组；E：黄芪甲苷高剂量组；F：缬沙坦组 |
在CHF的发生发展的过程中，心室重构、细胞肥大、心肌纤维化等机制发挥着巨大的作用，其中以心肌纤维化的作用更为突出，心力衰竭已经成为21世纪严重威胁老年人生命的心脏疾病之一[5]。 TGFβ1是一种由2条多肽链组成的二聚体(25kd)，正常情况下以非活性形式存在于细胞表面以及胞质中，经过纤维蛋白溶解酶溶解，成为活性型TGFβ1，在细胞的生长、分化、免疫调节、细胞外基质合成及损伤后的修复方面发挥着重要作用[6]。TGFβ1 是属于一组调节细胞生长和分化的细胞因子，其能够促成纤维分裂和胶原沉积，与多种器官的纤维化密切相关[7]。既往实验证实TGFβ1不仅能够诱导成纤维细胞增生并向肌成纤维细胞转化，而且促进Ⅰ、Ⅲ型胶原的高表达[8]。同时TGFβ1能够促进细胞外基质(ECM)的形成，并且能够抑制细胞外基质降解酶的活性，从而达到减少ECM降解的目的[9]。TGFβ1是一种促进心肌纤维化的重要生长因子，在各种原因引起的慢性心力衰竭中均有较高的表达，大量研究发现，在心肌纤维化时，TGFβ1表达增高与Ang Ⅱ的作用密切相关，AngⅡ可通过刺激TGFβ1及其Smads 信号转导通路，进而增加Ⅰ、Ⅲ型胶原和纤连蛋白的合成，并促进心肌纤维化的发生[10]。既往研究已经证实，CHF大鼠模型心肌组织中的TGFβ1表达明显增强。
黄芪甲苷作为传统的中药黄芪的提取制剂，在治疗心血管疾病方面药理作用广泛，主要表现在抑制心室重构、抑制心肌纤维化、改善心功能、改善能量代谢等方面[11, 12]。本研究观察黄芪甲苷不同剂量组与空白组进行比较发现，大鼠心肌组织中TGFβ1 mRNA、TGFβ1的表达都是明显减弱的(P＜0.01或P＜0.05)，并呈现出黄芪甲苷的剂量依赖性。在心肌组织切片中，黄芪甲苷不同剂量组中的纤维化以及CVF表达为不同程度的下降，也呈现出剂量依赖性，与TGFβ1、TGFβ1 mRNA的表达水平相吻合。血流动力学的监测结果、心肌病理切片、CVF监测等共同支持黄芪甲苷具有保护心功能、抑制心肌纤维化的作用。综上所述，该研究推测黄芪甲苷能够改善CHF大鼠心脏功能，减轻心脏的纤维化程度，可能是与其抑制心肌组织TGFβ1的过度表达有关，并呈现剂量的依赖性，具体机制可能是减少ECM的合成、促进ECM的降解，从而达到抑制心肌纤维化的作用。因此，该实验为黄芪甲苷抑制心肌纤维化、治疗CHF提供新的理论依据，为临床治疗慢性心力衰竭提供一种新的理想药物。由于本研究纳入的样本量相对较少，此结论有待多中心、大样本研究进一步的证实。同时考虑 CHF的发生发展机制错综复杂，CHF与其他多个因子关系密切[12](例如结缔组织生长因子、IL-1、IL-6等)，黄芪甲苷是否通过其他相关因子抑制CHF的进展尚需进一步的研究。
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