在女性生殖器官恶性肿瘤中，卵巢癌发病率占第3位，然而病死率一直位居首位。究其原因，大多数卵巢癌发病隐匿，约75%的患者在发现时已属于晚期。针对晚期卵巢癌，癌细胞减灭术加紫杉醇或铂类联合化学治疗，能暂时缓解疾病进展，但是肿瘤复发率却在80%以上[1, 2, 3, 4]。因此，迫切需要寻找卵巢癌的治疗新方法。随着分子生物学的飞速发展，分子靶向治疗已成为当今卵巢癌防治研究的热点。瞬时受体电位C1(TRPC1)是瞬时受体电位通道蛋白(TRP)家族中的一员，可通过调节钙离子内流参与细胞多种生理及病理活动。既往研究表明，TRP与多种肿瘤的发生及预后密切关联[5, 6]。本研究拟采用特异性靶向TRPC1的短发夹RNA(shRNA)转染卵巢癌细胞株ES-2，筛选并构建低表达TRPC1的稳定细胞株，通过对比转染空载体的对照组细胞，观察TRPC1基因表达变化对ES-2细胞增殖和凋亡的影响，初步探讨TRPC1在人卵巢癌细胞中的分子作用机制。
材料与方法一、细胞培养
人卵巢癌细胞株ES-2、SKOV3、OV1以及OV2与正常卵巢上皮细胞株IOSE80购自中国科学院上海细胞库。5株细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培基中，并置于5%CO2以及37℃培养箱内培养。倒置显微镜下观察细胞生长情况，待细胞长至约80%用含依地酸二钠(EDTA)的胰酶消化并传代培养。取对数生长期的细胞进行实验。
二、TRPC1的特异性shRNA转染
TRPC1 shRNA购自美国Santa Cruz公司(Cat. sc-270467-SH)。采用脂质体转染技术，具体操作流程参照英韦创津公司的Lipofectamine2000产品说明书。转染48 h后加入筛选抗生素G418，浓度为400 μg/ml，维持培养6 d后，G418浓度改为200 μg/ml；细胞扩增后，提取蛋白和RNA，进行荧光定量PCR和蛋白免疫印迹法鉴定。
三、TRPC1 mRNA表达水平的检测
采用荧光定量PCR法检测。稳定转染后，用Trizol提取总RNA，计算各组RNA浓度和纯度，根据试剂盒说明书进行逆转录反应：42℃反应60 min，95℃ 5 min，4℃ 5 min。荧光定量PCR：将反应管置入ABI7500系统中，设置反应条件为：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 20 s，共45个循环。引物序列如下： TRPC1上游5'-GATGTGCTTGGGA-GAAATGC-3'，下游5'-CAAGACGAAACCTGGAATGC-3'，长度232 bp； 内参GAPDH上游5'- ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，下游5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'，长度452 bp。该实验重复3次。
四、TRPC1蛋白表达水平的检测
采用蛋白免疫印迹法检测。TRPC1、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(p-PI3K)、细胞周期素D1(Cyclin D1)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)以及GAPDH抗体均购自美国abcam公司。提取细胞总蛋白后，采用BCA法定量计算总蛋白浓度，蛋白质凝胶电泳后转膜，室温封闭1 h，加入第一抗体(TRPC1、p-PI3K、Cyclin D1以及Bcl-2)，4℃孵育过夜，加入二抗，室温孵育1 h。采用化学发光法检测相关蛋白表达并进行灰度分析。该实验重复3次。
五、MTT比色法检测细胞增殖能力
取对数生长期的稳定转染TRPC1特异性shRNA的ES-2细胞，经胰酶消化后，对其进行细胞计数，以每孔5×103个细胞接种于96孔培养板中，ES-2/shRNA、ES-2/Con及ES-2细胞分别设置3个复孔，并设空白对照孔(不加shRNA，仅加培养基)，分别培养24、48、72 h。用MTT法检测570 nm波长处各个小孔的光密度(OD)值，并绘制生长曲线。
六、细胞凋亡实验
ES-2/shRNA、ES-2/Con及ES-2细胞分别接种于6孔板的小孔中：弃RPMI1640培养基，使用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞，胰酶消化细胞，收集于小离心管中，低速离心5 min，弃上清液。按Annexin V-FITC/PI双染凋亡试剂盒说明书操作，完成后用流式细胞仪检测。实验重复3次。
七、统计学处理
采用SPSS 13.0统计软件进行数据统计。计量资料以 
± s表示，体外细胞增殖能力的组间比较采用重复测量资料的方差分析；mRNA、蛋白定量及凋亡能力的组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
一、细胞TRPC1 mRNA表达水平
相对于正常卵巢上皮细胞IOSE80(设定为1)，4株人卵巢癌细胞(ES-2、SKOV3、OV1以及OV2细胞)的TRPC1 mRNA的相对表达量分别为5.02±0.08、3.23±0.05、1.78±0.08、2.13±0.04，见图 1。因ES-2的TRPC1 mRNA表达水平最高，故选择ES-2作为研究对象进行下一步实验。
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图 1 TRPC1 mRNA在4株人卵巢癌细胞和1株正常卵巢上皮细胞中的表达水平 |
二、特异性靶向TRPC1 shRNA稳定转染ES-2细胞后TRPC1的表达
特异性靶向TRPC1稳定转染ES-2细胞后，使用PCR及蛋白免疫印迹法验证沉默效率。结果显示，转染TRPC1 shRNA的ES-2细胞(ES-2/shRNA)、转染空载体的ES-2细胞(ES-2/Con)、未转染的ES-2细胞间TRPC1 mRNA及蛋白表达水平比较差异有统计学意义(F分别为48.374、42.542，P均 < 0.001)；与未转染及转染空载体的ES-2细胞相比，转染TRPC1 shRNA的ES-2细胞mRNA(t分别为10.453、9.649，P均 < 0.01,图 2B)及蛋白表达水平均明显降低(t分别为9.488、8.845，P均 < 0.01,图 2C)。
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图 2 shRNA明显抑制ES-2细胞的TRPC1表达 A：蛋白免疫印迹法检测结果；B：mRNA定量结果；C：蛋白定量结果；与ES-2及ES-2/Con细胞比较，**P < 0.01 |
三、TRPC1基因沉默对ES-2细胞增殖能力的影响
ES-2/shRNA、ES-2/Con、ES-2的增殖速度比较差异均有统计学意义(F=53.251，P < 0.001)，ES-2/shRNA细胞的增殖速度比ES-2/Con及ES-2细胞明显减慢(F分别为48.857、37.413，P均 < 0.001)，ES-2/Con与ES-2细胞的增殖速度比较差异无统计学意义(F=0.645，P=0.481)，见图 3。
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图 3 TRPC1对ES-2细胞体外增殖能力的影响 与ES-2及ES-2/Con细胞比较，**P < 0.01 |
四、TRPC1基因沉默对ES-2细胞凋亡的影响
ES-2、ES-2/Con和ES-2/shRNA细胞的凋亡率分别为(17.2±3.4)%、(18.3±2.5)%，(34.1±4.7)%，3组细胞的凋亡率比较差异有统计学意义(F=32.220，P < 0.001)。ES-2/shRNA细胞凋亡率明显高于ES-2及ES-2/Con细胞(t分别为5.046、5.141，P均 < 0.01)。ES-2细胞凋亡率与ES-2/Con细胞比较差异无统计学意义(t=0.451，P=0.675)，见图 4。
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图 4 TRPC1对ES-2细胞凋亡率的影响 A：ES-2细胞；B：ES-2/Con细胞；C：ES-2/shRNA细胞 |
五、TRPC1基因沉默对ES-2细胞的PI3K、Cyclin D1以及Bcl-2表达强度的影响
ES-2/shRNA细胞的Cyclin D1、Bcl-2、p-PI3K的表达均较ES-2和ES-2/Con细胞减弱,见图 5。
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图 5 TRPC1对ES-2细胞中PI3K、Cyclin D1以及Bcl-2表达的影响 |
卵巢癌是一种常见的妇科恶性肿瘤。由于卵巢癌早期缺少症状，症状缺乏特异性，筛查的作用有限，因此早期诊断比较困难，多数患者在就诊时已为晚期，而晚期病例的疗效欠佳。因此，卵巢癌的早期诊断显得非常重要[7]。钙离子是细胞内信号传导过程中重要的第二信使，细胞内钙离子平衡的紊乱参与肿瘤细胞的多种生物学行为，如肿瘤的生长、转移、侵袭和分化,是恶性肿瘤细胞发生、发展的重要因素[8]。TRP可通过介导钙离子内流调节肿瘤细胞的生物学行为。TRPC1是一种非选择性的阳离子通道，已被证实在前列腺癌、肺癌及乳腺癌等多种恶性肿瘤中表达升高，并预示预后较差[9, 10, 11, 12]。本研究表明，在人卵巢癌细胞中，TRPC1表达升高；通过RNA干扰法成功构建TRPC1低表达的ES-2细胞株后，发现ES-2/shRNA细胞的增殖能力较ES-2/Con和ES-2细胞下降。此外，ES-2/shRNA细胞的凋亡率比ES-2/Con和ES-2细胞升高。由此推测，TRPC1可能是卵巢癌的促癌基因。
PI3K/蛋白激酶B(AKT)信号通路已被证实和肿瘤的发生、发展密切相关。PI3K作为PI3K/AKT通路中重要的调节因子，其在肿瘤细胞增殖和凋亡过程中起着关键作用[13, 14]。一方面，PI3K对Cyclin D1有着间接调节作用，其磷酸化之后可活化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)从而增加Cyclin D1 mRNA翻译，进而促进细胞增殖；另一方面，PI3K磷酸化后活化AKT能够直接磷酸化促凋亡分子BAD，而磷酸化的BAD与Bcl-2发生结聚，从而使游离的Bcl-2发挥抗凋亡作用；此外，PI3K还能通过磷酸化forkhead家族转录因子，从而抑制凋亡相关基因如Fas-L、IGFBP1和Bim的转录[15]。因此，我们推测TRPC1调控人卵巢癌细胞的增殖以及凋亡可能与PI3K/AKT通路相关。
为了验证以上猜测，本研究检测了人卵巢癌细胞ES-2细胞在TRPC1下调后，p-PI3K、CyclinD1以及Bcl-2的表达水平均比2个对照组明显下降。提示了TRPC1调节人卵巢癌细胞的恶性行为的部分机制可能是通过对PI3K/AKT信号通路的调控，从而调节增殖以及凋亡相关因子的表达水平。然而值得注意的是，肿瘤发生、发展与多条信号通路相关，且这些信号通路之间可能还存在着交叉作用，下一步我们将对TRPC1在卵巢癌中的分子机制进行更全面及深入的研究。
综上所述，本研究探讨了TRPC1对人卵巢癌细胞增殖及凋亡的影响，发现TRPC1可通过活化PI3K等因子促进肿瘤细胞的增殖及抑制其凋亡。这为进一步揭示TRPC1基因与卵巢癌的关系提供新的实验依据，更为进一步探索卵巢癌发生、发展的分子机制提供了新的思路。
| [1] | Jayson GC, Kohn EC, Kitchener HC, Ledermann JA.Ovarian cancer.Lancet,2014,384(9951):1376-1388. ( 1) |
| [2] | Vargas AN. Natural history of ovarian cancer. Ecancermedicalscience, 2014,8:465. (1) |
| [3] | Devouassoux-Shisheboran M, Genestie C.Pathobiology of ovarian carcinomas.Chin J Cancer,2015,34(1):50-55.(1) |
| [4] | Luvero D, Milani A, Ledermann JA. Treatment options in recurrent ovarian cancer: latest evidence and clinical potential.Ther Adv Med Oncol,2014,6(5):229-239. (1) |
| [5] | Han H, Yi F.New insights into TRP channels: Interaction with pattern recognition receptors.Channels (Austin),2014,8(1):13-19. (1) |
| [6] | Liu C, Montell C. Forcing open TRP channels: Mechanical gating as a unifying activation mechanism.Biochem Biophys Res Commun,2015,460(1):22-25. (1) |
| [7] | Mahajan N. Fertility preservation in female cancer patients: An overview.J Hum Reprod Sci,2015,8(1):3-13. (1) |
| [8] | Farfariello V, Iamshanova O, Germain E, Fliniaux I, Prevarskaya N. Calcium homeostasis in cancer: A focus on senescence. Biochim Biophys Acta,2015,1853(9):1974-1979. (1) |
| [9] | Ouadid-Ahidouch H, Dhennin-Duthille I, Gautier M, Sevestre H, Ahidouch A.TRP calcium channel and breast cancer: expression, role and correlation with clinical parameters.Bull Cancer,2012,99(6):655-664.(1) |
| [10] | 张骏, 朱震, 李雄伟,张忠夫. SiRNA沉默TRPC1基因对肺腺癌A549细胞增殖和侵袭的影响. 中华医学杂志,2013,93(28):2241-2243.(1) |
| [11] | He B, Liu F, Ruan J, Li A, Chen J, Li R, Shen J, Zheng D, Luo R.Silencing TRPC1 expression inhibits invasion of CNE2 nasopharyngeal tumor cells.Oncol Rep,2012,27(5):1548-1554. (1) |
| [12] | Asghar MY, Magnusson M, Kemppainen K, Sukumaran P, Löf C, Pulli I, Kalhori V, Törnquist K.Transient receptor potential canonical 1 (TRPC1) channels as regulators of sphingolipid and VEGF receptor expression: implications for thyroid cancer cell migration and proliferation.J Biol Chem,2015,290(26):16116-16131. (1) |
| [13] | Davis WJ, Lehmann PZ, Li W. Nuclear PI3K signaling in cell growth and tumorigenesis.Front Cell Dev Biol,2015,3:24.(1) |
| [14] | 廖山婴,朱小波,王蓓蓓, 马娟,沙卫红. PPARγ、PTEN、Akt在胃癌中的表达及其与胃癌生物学行为的关系. 新医学,2014, 45(2):394-398.(1) |
| [15] | Nikoletopoulou V, Markaki M, Palikaras K, Tavernarakis N. Crosstalk between apoptosis, necrosis and autophagy.Biochim Biophys Acta,2013,1833(12):3448-3459.(1) |