鼻咽癌是我国常见的一种头颈部恶性肿瘤，因鼻咽黏膜下间质富含淋巴组织，易早期发生淋巴结的转移，预后较差。因此探讨鼻咽癌的发生发展机制，寻找鼻咽癌转移的分子靶向治疗靶点将为治疗鼻咽癌提供新的思路和方法。E-钙黏蛋白(E-cadherin)是上皮组织中的一类依靠Ca2+的细胞间黏连跨膜糖蛋白分子，在维持细胞间黏附的稳定和细胞极性中发挥重要作用。E-cadherin的表达与肿瘤的侵袭能力呈负相关。E-cadherin的表达下调或抑制会开启上皮-间质转化(EMT)，并导致肿瘤的浸润及转移。巢蛋白是第四类中间丝蛋白，早期主要用于神经系统肿瘤干细胞的研究，新近研究发现巢蛋白在多种恶性肿瘤中均有表达，且巢蛋白的表达与肿瘤的恶性程度及远处转移率呈正相关[1, 2, 3, 4]。本研究采用免疫组织化学的方法检测鼻咽癌组织中E-cadherin、 巢蛋白及肿瘤预后指标Ki67和P53的表达情况，分析其与鼻咽癌转移的相关性。
对象与方法一、研究对象
收集郑州人民医院2011年7月至2015年1月在病理科活组织检查(活检)确诊为鼻咽癌的患者43例，男25例、女18例，年龄30～78岁，其中临床分期Ⅰ期4例、Ⅱ期8例、Ⅲ期18例、Ⅳ期13例；有淋巴结转移30例，无淋巴结转移13例；非角化性癌35例，角化性鳞状细胞癌8例。另外收集21例经病理活检确诊为鼻咽部慢性炎症患者作为对照组，其中男10例、女11例，年龄15～67岁。
二、试剂及方法
即用型鼠抗人单克隆抗体、SP检测试剂盒、DAB显色剂均购自福建迈新生物公司。新鲜切除标本立即10%福尔马林固定，然后进行后续的制片。免疫组织化学方法采用SP法，按照试剂盒说明书方法染色。用PBS代替一抗为阴性对照，阳性对照采用已知强阳性表达的组织。
三、判断标准
巢蛋白主要表达于肿瘤细胞细胞质，E-cadherin主要表达于肿瘤细胞细胞膜或者细胞质，Ki67和P53主要表达于肿瘤细胞细胞核。
四、统计学处理
采用SPSS13.0统计软件进行数据分析。E-cadherin和巢蛋白等免疫标记物在不同组间表达差异采用χ2检验；E-cadherin和巢蛋白在鼻咽癌组织表达的相关性用交叉分类2×2列联表的关联分析。P＜0.05为差异有统计学意义。
结果一、E-cadherin、巢蛋白、Ki67和P53在鼻咽癌组和对照组表达的比较
鼻咽癌组织中，E-cadherin染色阳性细胞在细胞膜或者细胞质内出现棕黄色颗粒(图 1A)；巢蛋白染色阳性细胞为细胞质内出现棕黄色颗粒(图 1B)；Ki67和P53染色阳性细胞为细胞核内出现棕黄色颗粒(图 1C、1D)。
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图 1 E-cadherin、巢蛋白、Ki67和P53在鼻咽癌细胞中的表达(SP,×100) A：E-cadherin在鼻咽癌细胞中的阳性表达；B：巢蛋白在鼻咽癌细胞中的阳性表达；C：Ki67在鼻咽癌细胞中的阳性表达；D：P53在鼻咽癌细胞中的阳性表达 |
鼻咽癌组E-cadherin、巢蛋白、Ki67和P53的阳性表达率与对照组比较差异均有统计学意义(P均＜0.05)，见表 1、2。
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表 1 不同鼻咽组织中E-cadherin和巢蛋白的表达情况 |
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表 2 不同鼻咽组织中Ki67和P53的表达情况 |
二、鼻咽癌组织中E-cadherin和巢蛋白的表达与临床病理特征的关系
E-cadherin和巢蛋白在鼻咽癌不同组织学类型非角化性癌和角化性癌中的阳性表达无统计学差异(P均＞0.05)；不同临床分期的鼻咽癌组织中阳性表达比较差异均无统计学意义(P均＞0.05)；无淋巴结转移的鼻咽癌组E-cadherin的阳性表达明显高于有淋巴结转移的鼻咽癌组，2组比较差异有统计学意义(χ2=6.644，P＜0.05)。有淋巴结转移的鼻咽癌组巢蛋白的阳性表达明显高于无淋巴结转移的鼻咽癌组，2组比较差异有统计学意义(χ2=19.258，P＜0.01)，见表 3。
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表 3 cadherin和巢蛋白在鼻咽癌各临床病理特征之间的关系 |
三、E-cadherin和巢蛋白在鼻咽癌组织中表达的相关性
38例E-cadherin蛋白表达阴性的鼻咽癌组织中有29例巢蛋白表达阳性，9例表达阴性；5例E-cadherin蛋白表达阳性的鼻咽癌组织中有1例巢蛋白表达阳性，4例表达阴性。关联分析显示，E-cadherin和巢蛋白在鼻咽癌中表达呈负相关(P＜0.01)。
讨论上皮细胞癌是人类恶性肿瘤的最常见类型，其转移是肿瘤患者死亡的主要原因。细胞间的黏附作用对于维持组织细胞的正常形态及稳定非常重要，当其发生异常时，有可能会引起细胞的侵袭和转移。E-cadherin是上皮组织中的一类依靠Ca2+的细胞间黏连跨膜糖蛋白分子，因此维持稳定的细胞连接需要E-cadherin的存在，当E-cadherin下调或者消失就破坏了细胞间的连接，在发育和肿瘤浸润过程中,EMT随着E-cadherin功能的丧失而发生。EMT是胚胎发育中的一个基本过程，它使在特殊部位产生的上皮细胞从上皮组织分离并迁移到其它位置，是正常发育、伤口愈合及恶性上皮肿瘤发生的基础。在细胞生长因子介导的络氨酸或丝/苏氨酸(Ser/Thr) 激酶受体、整合素及其下游信号转导通路的刺激下，导致E-cadherin的下调和细胞骨架蛋白的改变而发生EMT。转化生长因子β(TGFβ)是EMT的诱导剂，作用于受体Ser/Thr 激酶从而使胞浆的Smads活化入核，激活抑制剂E-cadherin的Snail家族诱导EMT[1]。有文献报道，在食管腺癌中，转录因子Slug通过抑制E-cadherin转录启动子而抑制E-cadherin的转录，最终与其他信号分子一起参与EMT过程[5]。在黑色素瘤中，ET-1上调Snail mRNA,同时下调E-cadherin mRNA，ET-1在卵巢癌中诱导EMT，促进肿瘤的浸润和转移[6]。本研究显示在鼻咽癌组织中E-cadherin的阳性表达率明显低于对照鼻咽炎组织，分析其与鼻咽癌各临床病理特征之间的关系，发现E-cadherin的阳性表达率在有淋巴结转移组明显低于无淋巴结转移组，与鼻咽癌的组织学类型及临床分期无关。提示E-cadherin的低表达可能与鼻咽癌的浸润转移有关。E-cadherin可能通过某种信号通路诱导开启EMT，参与肿瘤细胞的迁移与侵袭。目前国内还无相关研究。
巢蛋白最初被检测到主要表达于胚胎发育时期的神经干细胞和前体细胞，在成体中，巢蛋白仅在小部分的组织和细胞中表达，但在缺血、炎症及脑损伤等病理状态下，巢蛋白也呈现返祖性表达[7]。巢蛋白可表达于肝癌组织中的新生血管内皮细胞，定量检测并对比癌组织和癌旁组织巢蛋白的表达，结果显示，两者的表达强度之间存在着显著差异，推测巢蛋白可以作为肝癌新生血管的标记物[8]。血管发生对于肿瘤的生长和转移是非常重要的。有文献报道，高度血管化的肿瘤具有非常差的预后[9, 10, 11]。CD34和CD31是血管内皮细胞标记，然而在增生的血管内皮细胞却只能检测到巢蛋白的表达。基于这个原因，巢蛋白被认为是在生理和病理条件下新生血管的重要标记[12]。随着对巢蛋白研究的深入，发现在多种类型的实体瘤中都检测到巢蛋白的表达。并且发现巢蛋白的表达与肿瘤的恶性分型有很大的关系。2004年Thomas等[13]报道，低度恶性和低转移潜力的神经母细胞瘤归因于低水平的巢蛋白的表达。在神经外胚层肿瘤中，高水平的巢蛋白就意味着最恶性的细胞类型，在高转移的人胶质母细胞瘤和星形细胞瘤的浸润部分，巢蛋白的表达增高，巢蛋白在黑色素瘤的肿瘤侵袭中也发挥作用[14, 15, 16, 17, 18]。生物信息学的研究发现巢蛋白 DNA序列中含有与Snail/Slug高度亲和的E-box序列，从而推测，巢蛋白可能通过Snail/Slug相互作用而参与肿瘤的转移和恶性表型的发生过程。本研究结果表明在鼻咽癌组织中巢蛋白的阳性表达率明显高于鼻咽炎组织，并且巢蛋白的阳性表达率与患者淋巴结的转移有关，与鼻咽癌的组织学类型及临床分期无关。这个结果提示巢蛋白可能通过促进新生血管的生长及某些信号通路参与鼻咽癌的浸润及转移。
本实验初步分析了E-cadherin和巢蛋白在鼻咽癌组织中阳性表达的相关性，两者呈负相关。最近研究结果报道，Snail,E12/E47等E-cadherin转录抑制子可以通过E-cadherin启动子近端的E-box 相互作用而抑制E-cadherin的表达，而生物信息学的研究发现巢蛋白 DNA序列中含有与Snail/Slug高度亲和的E-box序列，因此E-cadherin和巢蛋白可能通过共同的信号通路开启EMT，增加肿瘤的迁移能力，促进新生血管的生成，增加鼻咽癌的侵袭力，参与鼻咽癌淋巴结的转移，影响鼻咽癌的进展[19, 20]。
Ki67是反映恶性肿瘤细胞增殖活性的一项重要指标，P53是反映恶性肿瘤预后的一项重要指标，Ki67和P53的表达越高就意味着肿瘤有着更差的预后[21]。本研究结果显示Ki67和P53在鼻咽癌组织的阳性表达均高于鼻咽炎组织，与巢蛋白的表达一致，即Ki67、P53和巢蛋白高表达的鼻咽癌有淋巴结转移的高风险，预示着该肿瘤有较差的预后。因此综合检测巢蛋白、Ki67和P53对于预测鼻咽癌的生物学行为有一定意义。
综上所述，免疫组织化学联合检测E-cadherin、 巢蛋白及肿瘤预后指标Ki67和P53，有利于预测鼻咽癌患者转移风险，为寻找新的分子靶向治疗靶点提供新线索。
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