前列腺癌是老年男性较多见的恶性肿瘤之一。2015年，前列腺癌在美国成为男性最常见的恶性肿瘤[1]。近年来,我国前列腺癌的发病率及病死率均有明显上升的趋势。本研究前期针对雄激素受体(AR)模板DNA第4外显子2 447～2 461核苷酸同聚嘌呤·同聚嘧啶靶序列设计了三螺旋形成寡核苷酸(TFO)，序列为5’-GGAGAGGAAGGAGGA-3’，并且利用125I标记TFO，成功在体内、体外水平抑制前列腺癌移植瘤的生长[2]。纳米粒由于粒径小、容易被组织细胞摄取，是应用广泛、很有前景的基因载体。本研究选择已被FDA批准的聚合物聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)为材料，并进行聚乙二醇化(PEG)修饰，制备载125I-TFO的纳米粒(125I-TFO-NP)，并初步探讨其对前列腺癌细胞的抑制作用。
材料与方法一、材 料
人前列腺癌细胞株LNCaP由美国菌种保藏中心(ATCC)提供，购自南京凯基生物科技发展公司。PLGA-PEG(分子量100 000)，由上海丽昂化学有限公司合成。蛋白质碘化试剂Sulfo-SHPP (水溶性，Bolton-Hunter法)、水包油乳化剂Pluronic F68、乳化剂Tween 80，均购自上海西宝生物科技有限公司。TFO由上海生工生物工程公司合成，采用全硫代磷酸修饰。兔抗人AR单克隆抗体、山羊抗兔二抗均由广州杰特伟生物科技有限公司提供。
二、方 法
1. TFO的125I标记、稳定性试验与验证
应用Bolton-Hunter法进行TFO的125I标记，超滤离心纯化后，获得125I标记的TFO(125I-TFO)，纸层析法测定标记率。应用含10%胎牛血清1640培养基，于37℃孵育标记产物，分别于1、2、4、6、12、24、48、72 h后测定放射化学纯度。将标记产物进行聚丙烯酰胺(PAGE)凝胶电泳，硝酸银染色PAGE凝胶，并使用磷屏显像验证125I与TFO的偶联。
2. 复乳化溶剂挥发法制备包载125I-TFO的纳米载体颗粒与性状测定
冰浴下，内水相(含F68的125I-TFO溶液)逐滴加入有机相，超声乳化，形成初乳(W1/O)；初乳逐滴加入含Tween 80的外水相，超声乳化，制成复乳(W1/O/W2)，磁力搅拌蒸发，获得载125I-TFO纳米粒(125I-TFO-NP)，高速离心洗涤3次后，真空冷冻干燥。同法，制备载TFO的PLGA-PEG纳米粒(TFO-NP)、空PLGA-PEG纳米粒(NP)作为对照。测定纳米颗粒的平均粒径、粒径分布，电子显微镜下观察纳米粒子的表面形态。萃取法测定纳米粒的载药量与包封率，纳米粒悬于磷酸盐缓冲液(PBS)，置于超滤离心管中37℃恒温气浴振荡，然后离心取滤液，用紫外分光光度计测定125I-TFO含量。
3. 125I-TFO-NP的性状及细胞摄取实验
LNCaP细胞于37℃、5%CO2培养箱中传代培养，取对数生长期细胞，接种于细胞培养板，细胞贴壁后分别加入无血清1640稀释的125I-TFO-NP(含125I-TFO 50 μg/ml)和未包裹125I-TFO(50 μg/ml)，每组3个复孔，2 h后吸尽药物，PBS洗3次。0.25%胰酶消化细胞，离心、弃上清，用γ计数器检测。
4. 125I-TFO-NP在体外的抗LNCaP细胞增殖作用检测
将对数生长期的LNCaP细胞接种于细胞培养板，设立空白对照组、125I-TFO组、空白纳米粒(NP)组、载TFO纳米粒(TFO-NP)组及载125I-TFO纳米粒(125I-TFO-NP)组，其中空白对照组加等体积的1640培养基、125I-TFO组加等放射性活度的125I-TFO、NP 组加等质量的空白纳米粒、TFO-NP组加等量的TFO，每组设3个复孔。孵育24 h后，培养48 h。CCK-8法测定细胞增殖抑制率，实时荧光定量PCR测定AR mRNA表达水平，蛋白质免疫印迹法测定AR蛋白表达水平。
三、统计学处理
使用SPSS 13.0软件处理数据。计量资料以
±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t或Dunnett’s t3检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
一、125I-TFO标记率、放射化学纯度、标记化合物的稳定性及125I-TFO偶联的验证
125I的标记率为86.87%，放射化学纯度为96.21%。37℃孵育1、2、4、6、12、24、48、72 h后，放射化学纯度分别为95.05%、93.96%、93.72%、93.68%、91.70%、90.82%、90.47%、82.05%。在TFO被硝酸银染色处出现了放射性浓聚显影，证明125I与TFO成功偶联，见图1。
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图1 125I-TFO偶联的验证 A：TFO和125I-TFO(黑色箭头)的磷屏成像图；B:TFO(白色箭头)和125I-TFO(黑色箭头)的尿素-PAGE电泳图 |
二、125I-TFO-NP的表面性状、载药量、包封率及缓释特性
1. 125I-TFO-NP的粒径分布及表面形态
所得纳米粒的粒径为(298.2±0.5)nm。扫描电镜测得纳米粒呈球形，形态较好，见图2。
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图2 125I-TFO-NP的粒径分布及表面形态 A：125I-TFO-NP的粒径及分布；B：电子显微镜下125I-TFO-NP的粒子形态 |
2. 125I-TFO-NP的载药量及包封率
所得纳米粒的载药量为(1.89±0.13)μg/mg，包封率为(70.6±6.6)%。
3. 125I-TFO-NP的缓释特性
125I-TFO-NP在pH 7.4、37℃的PBS，有明显的缓释特性，在8 h后释放量达24.26%，72 h累计释放量达47.22%，见图3。
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图3 125I-TFO-NP的药物释放曲线 |
三、LNCaP对125I-TFO-NP的摄取试验
125I-TFO-NP 组的放射性计数为149±3，高于NP组及125I-TFO组(t分别为37.342、35.639，P均＜0.001)，125I-TFO组及NP组比较差异无统计学意义(t=1.700，P>0.05)。可见LNCaP对125I-TFO-NP的摄取比例明显高于未包裹的125I-TFO，LNCaP对未包裹的125I-TFO摄取极少，见图4。
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图4 LNCaP对125I-TFO-NP的摄取 与空白组比较，*P＜0.01 |
四、125I-TFO-NP对LNCaP增殖抑制的影响
1. 各组LNCaP细胞增殖抑制率比较
TFO-NP组与125I-TFO-NP组的LNCaP细胞增殖抑制率分别为(26.91±3.57)%、(48.07±2.87)%，均高于空白对照组(t分别为16.312、9.134，P均＜0.01)，且125I-TFO-NP组的细胞增殖抑制率高于TFO-NP组(t=7.185，P＜0.01)。125I-TFO组与NP组的细胞抑制率分别为(4.31±0.71)%、(2.95±0.44)%，与空白对照组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，见图5。
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图5 125I-TFO-NP对LNCaP增殖的影响 与空白对照组比较，*P＜0.01 |
2. 各组LNCaP中AR mRNA表达水平的比较
125I-TFO-NP组与TFO-NP组的AR mRNA表达 水平均低于空白对照组(t分别为-186.291、-1 118.132，P均＜0.01)，125I-TFO-NP组低于 TFO-NP组(t=-45.893，P＜0.01)。125I-TFO组与NP组的AR mRNA表达水平与空白对照组比较差异均无统计学意义(t分别为-6.718、-6.049，P均>0.05)，见图6。
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图6 125I-TFO-NP对LNCaP中AR mRNA表达水平的影响 与空白对照组比较，*P＜0.01 |
3. 各组LNCaP中AR相对蛋白表达水平比较
125I-TFO-NP组与TFO-NP组LNCaP 的AR相对表达水平均低于空白对照组(t分别为-83.142、-57.113，P均＜0.01)，其中125I-TFO-NP组的AR相对表达水平低于TFO-NP组(t=-12.32，P＜0.05)。125I-TFO组与NP组的AR相对表达水平与空白对照组比较差异无统计学意义(P均>0.05)，见图7。
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图7 125I-TFO-NP对LNCaP中AR相对蛋白表达水平的影响 A：蛋白免疫印迹结果；B：定量分析结果;与空白对照组比较，*P＜0.01 |
雄激素和AR在男性性征的表达上起核心作用，AR基因的突变以及AR功能区、DNA结合域和配体结合区的结构改变可能是引起前列腺癌发生、发展的机制[3]。AR被认为是治疗前列腺癌的重要靶点[4]。本研究设计靶向AR的TFO，并以125I标记，通过反基因治疗和放射性核素内照射方法，协同增强对前列腺癌细胞增殖的抑制作用。放射性碘标记蛋白质或多肽的方法应用于核酸的标记，所得到的产物标记率较低，使用Bolton-Hunter试剂，将125I间接地标记于TFO上，获得标记率达86.87%、放射化学纯度高达96.21%的反应产物。37℃孵育至48 h后，放射化学纯度仍大于90%，能有效保证后续应用。125I标记产物的核酸条带能在磷屏显像仪上显色，说明125I 通过BH试剂成功偶联至TFO上。
PLGA具有良好的生物相容性和安全性，在体内被分解为正常的代谢产物，是纳米载药系统研究中常用材料[5]。经PLGA纳米粒包裹的药物，可有效减少药物在体内环境中的降解，具有体内缓释特性，可延长其生物半衰期，提高生物利用度。纳米粒子由于体积微小，容易被组织细胞摄取，但也易被单核-巨噬细胞或网状内皮细胞清除。
粒径小于200 nm或经PEG修饰后的纳米粒子可减少其被网状内皮细胞清除，延长在生物体内的半衰期[6]。本研究使用了各种外水相稳定剂，使纳米粒的粒径符合条件，且能安全地应用于后续的体内外实验。药物的包封率和载药量主要受药物在材料中的溶解性影响，鉴于主要药物125I-TFO与PLGA不同的溶解性，使用复乳溶剂蒸发法制备纳米粒。此法药物易从内水相泄漏至外水相，使所得纳米粒的包封率降低，选择合适的内水相稳定剂，能提高包封率[7]。Tween80作为外水相稳定剂可更有效地降低纳米粒的粒径，Tween80有溶血性，但较同类产品弱，且可以通过洗涤和真空冷冻干燥去除；选择F68为内水相稳定剂，可有效提高纳米粒的包封率，且F68无生理活性、溶血性，对皮肤无刺激性，毒性小，是少数可以经静脉注射的乳化剂，作为药用辅料对人体安全性高[8]。
本研究制得的纳米粒呈均匀球形，平均粒径为298.2 nm，125I-TFO的包封率为70.56%，载药量为(1.89±0.13)μg/mg，在8 h后释放量达24.26%，体外缓释作用可持续30 d以上。纳米包载的药物在短时间被大量释放，称为突释效应，本次制备的纳米粒突释量较小，原因可能是选用的材料PLGA-PEG分子量较大。如选择PLGA1160507-PEG3400所制备的纳米粒可能有更强的缓释特性[9]。考虑到体内多种水解酶的存在，可以推断纳米粒在体内的突释量应比在体外更多，这为下一步的体内外抗肿瘤实验提供了保证。
125I-TFO为水溶性分子，不易被细胞直接摄取。PLGA-PEG纳米粒包载后，LNCaP通过胞吞作用将125I-TFO-NP吞噬入细胞，对125I-TFO的摄取量显著增加。在细胞培养液内分别加未包裹125I-TFO、NP、TFO-NP、125I-TFO-NP，
结果显示125I-TFO-NP组明显比125I-TFO组、NP组、TFO-NP组有更强的抑制效果。荧光定量PCR结果表明，125I-TFO-NP组内AR mRNA及蛋白表达水平均明显低于对照组。载125I-TFO的纳米粒可能通过抑制AR，抑制LNCaP的增殖。
综上所述，本研究通过制备标记率、放射化学纯度较高的125I-TFO，并使用复乳化溶剂挥发法制备了理想的纳米基因载体，其缓释和持续作用等特性可以作为体内反基因放射治疗的理想平台。
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