自噬是与真核生物关系密切的基础生理过程，通过细胞自我消化累积的蛋白质细胞器等各类复杂的细胞质成分，从而调节控制真核生物细胞内成分的数量与质量。现今，已有自噬与各种疾病的关系研究[1]。随着近年研究的逐步深入，巨噬细胞的自噬对于清除胞内病原体有何重要作用逐渐受到关注[2, 3]。自噬的作用机制在肺部疾病中，尤其在COPD、特发性肺纤维化、肺结核等疾病中已有较透彻的研究[4]。关于自噬与肺部感染性疾病，如胞外菌感染的研究仍较少。近年， 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)已成为引起医院内和社区相关性感染的重要致病菌之一，其治疗形式较为严峻[5]。已有研究发现，自噬可以清除某些胞内菌，如李斯特菌、沙门菌和结核分枝杆菌[6]。对于胞外菌MRSA感染细胞，巨噬细胞除吞噬外能否产生自噬的相关研究仍较少。本研究以小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7为对象，观察自噬在MRSA肺部感染中的作用，旨在探讨MRSA感染巨噬细胞对其自噬功能的影响。
材料与方法一、材 料
1. 细胞系及菌株
小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7购于中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心；MRSA菌株为由我院呼吸科实验室分离鉴定的临床菌株。
2. 主要试剂及仪器
DMEM高糖培养基、胎牛血清、青霉素和链霉素购于美国Life公司，Syber Green Mix实时定量PCR 检测试剂盒购于美国Life公司。LC3多克隆兔抗体购于美国Sigma公司；Beclin1单克隆抗体购于美国Cell Signaling Technology公司，内参抗体β-actin兔一抗购于中国谷歌生物公司，辣根过氧化物酶(HRP) 标记的羊抗兔二抗购于广州威佳科技有限公司，增强化学发光(ECL)检测试剂盒购于广州聚研生物科技有限公司，细胞培养6孔板购于美国Corning公司。凯基全蛋白提取试剂盒及凯基BCA法蛋白浓度检测试剂盒购于广州杰特伟生物科技有限公司，蛋白质印迹法配胶成分30%聚丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液、10%十二烷基硫酸钠(SDS)溶液、过硫酸铵(APS)购于广州威佳科技有限公司，蛋白电泳转膜系统购于美国Bio-Rad公司。
二、方 法
1. 细胞培养
RAW264.7细胞用含10%胎牛血清、100 kU/L青霉素和100 mg/L 链霉素的DMEM高糖培养基培养于25 ml的透气盖培养瓶内，将培养瓶置于37℃、5%CO2培养箱内，根据细胞数目形态，当细胞融合至60%~70%时将细胞传代，平均约2～3 d传代1次，保持实验用细胞处于对数生长期，细胞状态良好，在普通光学显微镜下折光度透亮，未见大量颗粒及细胞碎片。
2. 细菌培养
将冻存于-80℃的MRSA菌种在室温下解冻后，接种于血琼脂培养基，置于37℃温箱培养24 h，然后测定其在600 nm处吸光度(OD600) ，当 OD600=0.6，即约1×109/ml时，置于16%甘油在-80℃冻存。
3. MRSA感染细胞
将处于对数生长期的RAW264.7细胞按1×106/ml的密度接种于6孔板，每孔加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液2 ml，培养过夜，待每孔细胞数增至2×106时开始感染，根据预实验结果，按细菌∶细胞=10∶1将MRSA加入培养板中感染细胞。第一部分的实验分为2组：空白处理作为对照组，MRSA感染作为实验组。第二部分的实验为MRSA刺激时间点检测：将细胞均匀种于6孔板中，共分7组，第1组为对照组、第2组加入MRSA作用30 min、第3组加入MRSA作用60 min，组间相隔30 min，以此类推，第7组MRSA作用时间为180 min。每组实验重复3次，取均值作为结果。
4. ATG mRNA表达水平的检测
采用荧光定量PCR(qPCR)法：根据Gen Bank数据库的ATG基因序列，分别设计ATG5、ATG7、ATG12特异性引物，由美国Life公司合成，引物序列见表1。收集上述各组细胞，在6孔板每孔加入1 ml Trizol提取细胞总RNA并进行模板DNA第一链合成，然后加入10 μl Syber Green混合物，反应体系总体积20 μl，采用ABI 7500系统进行PCR反应。反应条件为：50℃ 2 min，95℃ 2 min预变性，95℃15 s变性，60℃1 min退火，共40个循环，95℃15 s，60℃1 min，95℃30 s，60℃15 s延伸。反应后得到溶解曲线，记录目的基因与内参基因达到某一阈值的Ct值，将目的基因与内参基因Ct值进行比较后再与对照组比较，计算ATG mRNA相对表达量：ATGmRNA=2-ΔΔCt。
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表1 引物序列 |
5. 自噬相关蛋白Beclin1及微管相关蛋白轻链3(LC3)表达水平的检测
MRSA感染细胞后，收集细胞加入现配的蛋白裂解液(每孔50 μl)，用细胞刮刮取蛋白，收集混合液于4℃以12 000 r/min离心15 min，收集上清液，于562 nm波长下用二喹啉甲酸(BCA)法检测蛋白浓度，加入5倍体积蛋白上样缓冲液混匀，煮沸10 min，－80℃保存。采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳法，下层12%分离胶，上层5%浓缩胶，蛋白上样量20 μg，85 V恒压电泳，待蛋白标记物分出条带后，将电压调为110 V，当电泳至条带接近底端时，停止电泳，260 mA恒流转膜1.5 h将蛋白转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，根据预染蛋白标记物，剪下不同的目的蛋白于湿盒内孵育，加入5%脱脂奶粉室温封闭1 h，TBST缓冲液洗膜3次，每次洗10 min，一抗稀释比例LC3为1∶1 000、Beclin1为1∶2 000、β-actin为1∶2 000，4℃过夜后，TBST缓冲液洗膜3次，每次10 min，室温孵育二抗1 h(稀释比例为1∶2 000) ，TBST缓冲液洗膜3次，每次15 mim，ECL发光液A液、B液等体积混合后敷于蛋白膜上，于Chemi Scope化学发光成像系统显影，运用Image J软件分析LC3(取LC-Ⅰ条带)及Beclin1的蛋白灰度值，作为其蛋白相对表达量。
三、 统计学处理
采用SPSS 22.0软件统计分析。数据以
±s表示，并进行方差齐性检验，2组间比较采用t检验。多组完全随机设计资料比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
一、感染MRSA 对RAW264.7细胞中ATG表达的影响
感染MRSA 3 h后，实验组RAW264.7细胞的ATG5、ATG7、ATG12的mRNA表达水平均高于对照组(P均＜0.01)，见表1。
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表1 感染MRSA 3 h后RAW264.7细胞中ATG表达情况(±s)
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二、感染MRSA不同时间点RAW264.7细胞中的ATG表达情况
感染MRSA不同时间点组的RAW264.7细胞中，ATG5、ATG7、ATG12 mRNA表达水平比较差异均有统计学意义(F分别为36.551、41.073、19.662，P均＜0.001)。其中ATG7、ATG12 mRNA相对表达量在感染MRSA 180 min组最高，ATG5 mRNA相对表达量在感染MRSA 150 min组最高。180 min组的ATG7 mRNA表达水平为4.07±0.54，高于90 min组的2.08±0.01(t=9.025，P＜0.001)；180 min组的ATG12 mRNA表达水平为3.54±0.46，高于90 min组的1.66±0.19(t=9.253，P＜0.001)；150 min组的ATG5 mRNA表达水平为2.49±0.14，高于90 min组的1.83±0.25(t=2.650，P=0.024)，见图1。
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图1 感染MRSA不同时间点后RAW264.7细胞中ATG的表达情况 |
三、 感染MRSA对RAW264.7细胞中LC3及Beclin1蛋白表达的影响
感染MRSA 3 h后，RAW264.7细胞中LC3蛋白相对表达量在实验组为48 523±12 692、对照组为7 450±1 550，2组比较差异有统计学意义(t=14.692，P＜0.001)； Beclin1蛋白相对表达量在实验组为13 765±2 267、对照组为12 522±3 347，2组比较差异无统计学意义(t=0.533，P=0.619)，见图2。
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图2 感染MRSA后RAW264.7细胞中LC3及Beclin1的表达情况 A：蛋白免疫印迹法结果；B：定量分析结果 |
四、感染MRSA不同时间点RAW264.7细胞中LC3及Belin1蛋白的表达情况
感染MRSA不同时间点组的RAW264.7细胞中，LC3及Belin1蛋白相对表达量比较差异均有统计学意义(F分别为5.235、3.938，P均＜0.05)。LC3、Beclin1蛋白相对表达量均在感染MRSA 180 min组最高。其中LC3蛋白相对表达量在180 min组为57 010±3 978，在60 min组为45 383±6 273，2组比较差异有统计学意义(t=3.210，P=0.009)。Beclin1蛋白相对表达量在180 min组为86 440±5 024、60 min组为70 685±2 776，2组比较差异有统计学意义(t=6.273，P＜0.001)，见图3。
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图3 感染MRSA不同时间点RAW264.7细胞中LC3及Belin1蛋白的表达情况 A：蛋白免疫印迹法结果；B：定量分析结果 |
巨噬细胞是固有免疫系统重要组成部分，在外来病原体入侵机体时，可以通过吞噬等非特异性免疫作用来杀伤病原体，并且可以通过抗原提呈诱导特异性免疫进一步杀死病原体。肺部感染性疾病中，巨噬细胞对于肺部的宿主防御功能必不可少，其能够监视暴露的气道，调节固有和适应性免疫[7]。
自噬是真核生物细胞内回收利用细胞质成分的一种降解机制。自噬过程包括将长寿命蛋白及胞内较大体积的细胞器成分隔离进入双层膜囊泡状结构，然后再运送至溶酶体进行降解，降解后的成分重新用来供应细胞能量及合成大分子的需要。因此，自噬被视为胞内回收机制 [8]。最早对于自噬分子机制的研究从酵母菌开始，随后发现大多数自噬基因出现于高等真核生物，表明自噬是一种进化高度保守的过程。在酵母菌中，自噬主要涉及适应饥饿，在多细胞生物体内，该途径涉及多条通路，例如程序性细胞死亡、胞内破损细胞器及沉积蛋白质的清除等[9]。从整体上而言，自噬与多种病理生理过程相关，包括肿瘤、神经退行性病变、感染等[10]。随着研究的逐步深入，学者们发现自噬与疾病的治疗相关，已有研究证明自噬与肿瘤治疗相关，可以提高肿瘤细胞对化学治疗药物的敏感性[11]。与哺乳动物自噬相关的基因统一命名为ATG。在哺乳动物细胞自噬泡形成过程中，由ATG3、ATG5、ATG7、ATG10、ATG12和LC3参与组成的2条泛素样蛋白加工修饰通路，在自噬过程起着至关重要的作用。LC3是酵母ATG8的类似物，当LC3前体形成后，首先加工成胞浆可溶性形式LC3-Ⅰ，并暴露出其羧基末端的甘氨酸残基，然后LC3-Ⅰ被ATG7活化,转移并被修饰成膜结合形式LC3-Ⅱ[12, 13]。本实验中LC3-Ⅰ较LC3-Ⅱ表达明显增多，考虑是否由于自噬属于动态过程，LC3-Ⅱ已逐渐被溶酶体降解， 故取LC3-Ⅰ条带作定量分析。
近几年，关于自噬与感染性疾病的研究逐渐增多[14]。金黄色葡萄球菌是可以引起人体从表皮感染至严重血源性感染等侵袭性感染的胞外菌，其感染率和患者病死率极高[15]。其中MRSA感染更为当前临床治疗的难题。虽然经典的研究证实，金黄色葡萄球菌是胞外菌，但其可逃避吞噬细胞的杀伤作用而存活于多种吞噬细胞中。更为严重的是，有研究显示其可存活于单核细胞、巨噬细胞、甚至中性粒细胞中[16]。β-内酰胺类和糖肽类抗菌药均难以进入上述免疫细胞，故治疗失败率高。因此，研究自噬对于胞内生存的MRSA有何作用及其与吞噬的关系，对阐明胞外病原体灭活及其免疫逃避机制均有重要意义。
已有研究表明，在肺泡上皮细胞A549受到结核分枝杆菌、A型链球菌和铜绿假单胞菌感染时，自噬可以清除病原体，对机体起到清除病原体的保护作用[17]。另外，自噬对于结核分枝杆菌亦具有杀伤作用[18]。目前，对金黄色葡萄球菌入侵单核细胞系MEF及Hela 细胞系产生自噬已有相关研究[19]。本研究主要观察MRSA感染巨噬细胞对自噬的影响，结果显示巨噬细胞在感染MRSA后，ATG5、ATG7、ATG12 mRNA及LC3蛋白相对表达升高，从基因水平及蛋白质水平证明感染MRSA可以激活巨噬细胞自噬，参与自噬过程的相关基因表达水平达峰时间不完全一致，表明自噬是一动态过程，基因激活存在先后顺序。但对于该类自噬的具体信号通路机制仍然未明，其是否与革兰阴性菌内毒素成分脂多糖诱导自噬过程类似，还是通过MRSA表面细胞壁某种成分诱导产生自噬，对此仍需要进一步研究[20]。另外，MRSA是否能够逃避自噬，自噬能否起到免疫作用，对肺炎预后有何影响，还需进一步实验研究[21]。
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