近年来，随着我国工业和建筑业的发展，高能量损伤大量增加，骨折患者也增加，骨折经治疗后不愈合的发生率为5%～10%[1, 2]。经典的治疗骨折不愈合的方法为重建骨折愈合所需的力学因素，显露骨折不愈合处，去除硬化的纤维组织后畅通髓腔，取髂骨植骨。此法虽然能使一些骨折不愈合或延迟愈合的病例实现愈合，但其创伤大，会造成骨折断端血运的破坏，存在感染风险，造成髂骨部分缺失及后续并发症。使用外固定架具有操作简单、手术时间短、出血少、愈合时间早等优势，有报道示，近几年出现的新技术即应用了外固定架加压-牵开-再加压治疗非感染性骨折不愈合[3]。本研究组拟从影像学、组织学、免疫组织化学检查(免疫组化)等方面对此技术进行研究。
材料与方法一、实验动物
102只8月龄、体质量为1.5～2.5 kg的雄性新西兰大耳白兔作为实验动物，由北京金牧阳实验动物有限公司提供。动物分笼标准饲养于清洁级环境下(承德医学院附属医院实验动物中心)，自由活动，温度控制于(25.0±0.5)℃，湿度为60%，定期消毒排风，饲养16周。试验中对兔的处置符合动物伦理学要求[4]。
二、实验模型的建立
根据赵震宇等[5, 6]的方法建立兔股骨骨折不愈合模型。将戊巴比妥钠50 mg/kg静脉注射于兔的耳缘静脉将其麻醉后，用电动褪毛器为其褪毛，常规碘伏消毒、铺单，手术过程严格无菌操作。取左股骨干外侧切口，暴露股骨中段。置入外固定架，在股骨远、近端分别用电钻自股骨外侧垂直股骨干钻透双侧骨皮质，平行拧入2枚直径2.0 mm半针，安装外固定架。用线锯将股骨截断，并去除截骨部位的骨膜和骨髓，并使骨折断端分离1.5 cm，然后彻底止血、冲洗伤口、逐层缝合[7]。术后肌内注射青霉素40万U，1次/日，共3 d。将兔分笼饲养，于术后8周摄X线片检查模型是否制作成功，成功则如图1A。102只兔中有5只因腹泻和麻醉意外死亡，9只因造模术后切口感染及内固定失效而无法进行下一步实验，余下87只造模成功。
三、造模成功后的处理方法
将造模成功的87只兔随机分为实验组、对照组、空白对照组，每组各29只。将实验组骨折不愈合断端复位后用外固定架进行加压-牵开-再加压治疗，先以0.5 mm/d的速度持续加压4周，然后以0.5 mm/d的速度持续牵开2周，再以同样的速度加压4周；将对照组的骨折不愈合断端复位后用外固定架加压，以0.5 mm/d的速度持续加压4周；将空白对照组的骨折不愈合断端复位后用外固定架固定，保证骨折端接触，既不加压也不牵开。
四、X线片检查
于处理后的第2、4、6、8、12周将3组麻醉后分别用计算机X线成像记录X线片拍摄情况，参照Ciotakis 等[8]制定的X线片骨痂评定标准判断治疗效果，即：断端边缘稍模糊，骨膜反应轻度，无骨痂者为0分；断端边缘明显模糊，内外骨痂密度略高于软组织，骨折间隙1/2以上出现骨痂者为1分；断端边缘大部分消失，内外骨痂密度接近于髓腔，骨折间隙1/2以上出现骨痂连接者为2分；断端边缘趋于消失，内外骨痂密度近似于皮质骨，骨折间隙1/2以上出现骨痂连接者为3分；断端边缘完全消失，内外骨痂密度等同皮质骨并连续，髓腔再通为4分，3～4分为骨折愈合。
五、制作标本
处理后的第2、4、6、8、12周行X线片检查后，3组分别随机选取5只兔处死，截取其左股骨中段骨痂和软组织，将骨痂和软组织用生理盐水冲洗后立即放入4%多聚甲醛(pH=7.4)中，于4℃固定24～48 h，用20%乙二胺四乙酸二钠(EDTA2Na)脱钙2～6周，3～4 d更换1次脱钙液，脱钙满意后，用梯度酒精进行脱水，二甲苯透明，纵向石蜡包埋，做成层厚6 μm的纵向组织切片，行苏木素-伊红(HE)染色，进行组织学观察。
六、免疫组化染色
将石蜡包埋后的组织块切片后按说明书操作进行免疫组化染色，在20×20显微镜视野下，以细胞计数方法测定血管内皮生长因子(VEGF)表达程度，随机选择5个视野，对细胞(包括着色和未着色)进行计数。试验中所用VEGF多克隆抗体由上海艾博抗贸易有限公司提供，组织的染色采用SP法。
七、统计学处理
采用SPSS 20.0软件处理数据。X线片骨痂评定结果用
±s表示，采用重复测量资料的方差分析对比组间差异及时间效应
。各组骨折愈合率比较采用Fisher确切概率法，两两比较采用Bonferroni法校正检验水准(α’＝α/比较次数)
。以细胞计数方法判定VEGF的表达程度，并以±s表示，对各时点的数值进行方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。α为0.05。
一、影像学观察结果
1.实验组
治疗第2周时骨折断端边缘稍模糊，骨痂密度略高于软组织，断端出现将近1/2骨痂(图1B)；第4周时，断端边缘明显模糊，骨折间隙1/2以上出现骨痂；第6周时，断端边缘大部分消失，骨痂密度接近髓腔(图1C)；第8周时，断端边缘趋于消失，骨痂密度近似皮质骨，骨折间隙1/2以上出现骨痂连接；第12周时，剩余的9只兔中除1只(1/9)因内固定失效、骨折未愈合处，其余8只(8/9)兔骨折断端完全消失，骨痂密度等同皮质骨，骨折愈合(图1D)。
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图1 实验组各时间非感染性骨折不愈合恢复情况 A：模型制作成功(箭头所示)；B：断端加压4周后；C：牵开2周后；D：处理后第12周 |
2.对照组
第2周时，骨折断端模糊，骨痂密度略高于软组织，断端出现近1/2骨痂；第4周时，断端边缘明显模糊，内外骨痂密度接近于髓腔；第12周时，剩余的9只兔中有7只(7/9)断端骨痂连接少于50%，髓腔未再通，骨折未愈合。2只(2/9)断端边缘消失，髓腔再通，骨折愈合。
3.空白对照组
第4周时，萎缩、硬化的骨折断端未出现轻度骨膜反映，未见骨痂；第12周时，所有兔的骨髓腔仍为封闭，无1只愈合。
术后各组不同时间X线片骨痂评定情况见表1。第12周时，3组总体骨折愈合情况比较差异有统计学意义(P＜0.05)；两两比较示实验组的骨折愈合率高于其他2组(P均＜0.05/3)。
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表1 实验组、对照组及空白对照组不同时间X线片骨痂评定情况(±s)
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二、组织学观察
第2周时，实验组和对照组骨折断端有大量的炎性细胞浸润(图2A)；空白对照组断端为成熟的纤维结缔组织(图2B)。第4周时，实验组和对照组靠近骨折断端的两侧有少量骨膜细胞增生，已有部分成骨，并开始出现少量的软骨细胞填充骨折区，已无纤维结缔组织和肉芽组织，有少量血管生成，可见极少量吞噬死骨块的破骨细胞。第6周时，实验组出现大量的软骨细胞增生，并开始分泌软骨基质，成骨细胞也明显增多，其中可见由成骨细胞增生而来的骨小梁(图2C、D)；对照组软骨细胞及成骨细胞未见明显增多，有少量的骨痂形成。第8、12周时，实验组可见大量新骨形成，成骨细胞贴附于骨的边缘，且成骨过程基本完成；对照组仍未见软骨细胞及成骨细胞的增生，骨痂量也未见明显的增多；空白对照组断端为成熟的纤维结缔组织，有少量的软骨痂及骨痂。
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图2 非感染性骨折不愈合组织学观察图 A：纤维组织向软骨细胞转化(箭头所示)，HE×100；B：骨折不愈合病理，HE×100；C：软骨细胞(箭头所示)，HE×200；D：部分软骨细胞向成骨细胞转化(箭头所示)，HE×100 |
三、免疫组化观察结果
细胞(包括着色和未着色)个数见表2。实验组和对照组骨折断端开始加压后的4周内，可见少量轻微着色的单核细胞，着色较深的为肥大和成熟的软骨细胞，VEGF高表达呈强阳性的为和原始骨小梁相连的软骨细胞，而骨痂内幼稚的软骨细胞为阴性，在破骨细胞中也可看到VEGF的表达。4~6周时，实验组中肥大的软骨细胞及成骨细胞内可见VEGF持续高表达，对照组4周时曾可见VEGF高表达情况，但其后未能持续，空白对照组中未发现VEGF高表达的情况。6周后，实验组骨小梁在逐渐成熟过程中，成骨细胞逐渐减少，VEGF的表达也逐渐下降，而骨基质VEGF为散在阳性。
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表2 实验组、对照组及空白对照组骨痂中不同时间VEGF表达(着色细胞个数)的变化(±s)
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非感染性骨折不愈合分为肥大型和萎缩型。肥大型骨折不愈合的原因为固定不稳后引起的异常应力抑制了骨折愈合的进程。更换稳定的固定可使多能干细胞向成骨细胞分化，使骨折愈合。而萎缩型骨折不愈合断端组织无生物愈合的能力，治疗过程中需给予足够的生物学刺激促进组织再生。本实验以新西兰大白兔为研究对象，依据赵震宇等[5, 6]的方法造成股骨萎缩型骨折不愈合模型，造模成功后应用外固定架对断端采用加压-牵开-再加压技术治疗骨折不愈合取得成功。
一、外固定架加压-牵开-再加压技术治疗无菌性骨折不愈合的作用机制
骨折断端复位后逐渐加压过程除增加固定的稳定性外，断端纤维组织受到挤压逐渐坏死，坏死后的组织诱发炎症反应，开始刺激骨愈合的过程，重启骨折断端愈合的潜能。处理后在对断端加压的过程中，断端处于微小不间断移动加压状态，有利于成骨。而在对断端牵开的过程中，组织受到持续牵开的应力，促使其再生和修复，使前开的间隙发生成骨过程。而再加压过程能使新生成的骨组织被嵌压在断端，产生类似“自身植骨”的作用。这种加压-牵开-再加压的过程被称为“手风琴”技术[8]。
二、VEGF高表达促进骨折愈合
在实验过程中，我们通过组织学观察发现实验组和对照组断端被加压过程中，断端成熟的纤维结缔组织受压后逐渐转变为炎性肉芽组织。在加压的后期(第4周时)可见骨膜细胞增生并部分成骨，开始出现软骨细胞。对实验组骨折断端牵开2周后，断端的软骨细胞及成骨细胞明显增多，而对照组无此现象。对实验组再加压4周后，断端大量新骨形成，髓腔再通，骨折愈合。空白对照组断端只有少量的软骨痂及骨痂。同时，免疫组化结果显示，实验组和对照组第4周时VEGF的表达量比较差异无统计学意义，而第6、8、12周时实验组明显多于对照组。实验组、对照组VEGF的表达量均多于空白对照组，说明加压-牵开-再加压的过程能增加VEGF的表达，这可能是外固定架加压-牵开-再加压技术能治愈非感染性骨折不愈合的生物学机制之一。
我们认为造成VEGF增多的原因为：对骨折断端加压后，骨折的修复及肉芽组织的增长使得断端的血供减少、氧分压降低，缺氧环境能促进成骨细胞中VEGF的表达[9]。VEGF不仅可使血管生成增多，为成骨细胞提供足够的营养物质形成新的骨小梁，而且能促进成骨[10]。我们观察到实验组中VEGF在肥大的软骨细胞中强表达，其作用可能为通过自分泌和旁分泌的形式促进成骨细胞的增殖、分化、血管形成。相反，既无加压也无牵开的空白对照组的软骨细胞中VEGF的表达明显少，VEGF的减少抑制了软骨细胞向成骨细胞的转化和成骨细胞的增殖，该组无一只能治愈。
三、总 结
外固定架加压-牵开-再加压技术治疗非感染性骨折不愈合有效，该法可能通过增加VEGF的表达治愈非感染性骨折不愈合。本实验不足之处包括：①以新西兰大白兔为实验对象，虽达到预期效果，但因新西兰大白兔与人存在物种差异，外固定架加压-牵开-再加压技术应用于临床需在医学伦理及临床的允许下谨慎进行，取得显著成果后方可应用于临床；②仅通过对横行骨折不愈合进行实验，初步研究促进骨折愈合的轴向应力，尚不能为临床提供各种骨折类型的参考依据，还需从深度、广度进一步研究；③此技术不能解决截骨对肢体造成的短缩[10]。
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