强直性脊柱炎(AS)是一种常见的炎症性系统性风湿病，其发病率及致残率均较高，但病因及发病机制至今尚未完全明确[1, 2]。整合素是一类普遍存在的跨膜糖蛋白，参与细胞间及细胞与胞外基质(ECM)间的黏附及细胞信号的转导，介导包括炎症性疾病在内多种疾病的发生与发展[3]。踝蛋白1在整合素信号通路的活化过程中发挥了至关重要的调节作用。既往的蛋白质组学研究初步发现，AS患者PBMC的踝蛋白1表达上调，提示整合素信号通路可能涉及AS的发病及炎症调节[4]。故本研究拟通过流式细胞术 (FCM)检测AS患者单核及T细胞中踝蛋白1蛋白平均荧光强度(MFI) ，并以逆转录-PCR (RT-PCR) 法检测AS患者PBMC中踝蛋白1 mRNA的表达情况，同时以健康志愿者 (HV)及类风湿关节炎(RA) 患者为对照，比较踝蛋白1在3组中的表达差异，初步探讨踝蛋白1在AS发病及炎症活动中的作用及其临床意义。
对象与方法一、研究对象
纳入初诊活动期AS患者30例 (AS组) ，同时纳入活动期RA患者30例 (RA组) 。AS组患者入组标准：①年龄20～40岁；②符合1984年修订的AS纽约标准；③无其他慢性病病史；④入选前3个月内无急性感染史；⑤入组前3个月内未使用过任何缓解疾病的抗风湿药物及糖皮质激素；⑥无生物制剂使用史；⑦毕氏AS疾病活动指数(BASDAI)≥4。RA组患者入组标准：①年龄20～40岁；②诊断上满足1987年美国风湿病学会修订的RA分类标准；③为初治或病情反复的患者，近3月内未使用过糖皮质激素及其他免疫抑制剂；④疾病活动度评分 (DAS28-4) 均>5.1分；⑤近2月内无任何急性感染病史；⑥无其他慢性病病史。另纳入年龄20~40岁的30名HV (HV组) 作对照。本研究经医院伦理委员会批准，所有入组的个体均为自愿参加试验，并于入选时签署知情同意书。
二、标本采集
对入组的每例个体，均以真空EDTA抗凝管(2 ml及4 ml各1管)于空腹状态经外周静脉采血6 ml，立刻置4℃冰箱保存备用。其中2 ml静脉血于6 h内进行免疫荧光染色处理并于当日进行FCM分析；4 ml静脉血于2 h内用于分离PBMC，并提取总RNA用于RT-PCR实验。
三、方 法
1. 踝蛋白1的蛋白表达水平检测
取依地酸二钠 (EDTA) 抗凝全血标本100 μl，分别加入PE anti-human CD14 (美国BD Biosciences) 、PE-CY5 anti-human CD3 (美国BD Biosciences) 各5 μl混匀，经过避光孵育及离心后，加入红细胞裂解液并离心，弃去上清后充分固定，在破膜之后加入踝蛋白 1抗体 (美国Santa Cruz Biotechnology) ，最后加入FITC标记的二抗 (美国Santa Cruz Biotechnology) ，避光孵育待测。以FACS Calibur流式细胞仪 (美国Becton Dickinson)检测及分析PBMC(CD14+单核细胞及CD3+T细胞) 中踝蛋白1的MFI值。
2. 踝蛋白1的mRNA表达水平检测
采用RT-PCR法，将Trizol Regent(美国Introgen公司)加入PBMC裂解细胞，然后按1 ml含细胞裂解产物的Trizol加200 μl氯仿的比例加入氯仿萃取总RNA，并以异丙醇将总RNA析出后加入DEPC水溶解。按照RevertAid逆转录试剂盒 (加拿大Fermentas) 说明书合成模板DNA。通过Primer Premier 5.0设计引物，其中踝蛋白1基因的引物序列为：上游5′-CTGACAACAACCCTCAACGA-3′，下游5′-CTGTGGCAATGACATCTTCC-3′，踝蛋白 1基因扩增长度为1 186 bp；选用GAPDH为内参基因，其引物序列为：上游5′-TCCACCACCCTGTTGGTGTA-3′，下游5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，GAPDH基因扩增长度为452 bp。PCR反应总体积20 μl，按照2倍体积Taq Plus PCR Masker Mix(中国天根生物技术)说明书将各成分充分混合后，按照94℃预变性3 min、 94℃变性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸1 min，共30个循环，72℃延伸5 min。最后取PCR产物置2%琼脂糖凝胶电泳，成像仪拍摄并分析踝蛋白 1 mRNA的相对表达水平(踝蛋白 1 mRNA的光密度值/GAPDH mRNA的光密度值)。
四、统计学处理
使用SPSS 13.0统计软件处理数据。计量资料以
±s表示，多组间比较采用单因素分析，多组间两两比较采用SNK-q检验。计数资料组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
一、研究对象的临床特征
AS组30例患者，年龄(27.6±7.6)岁，男18例、女12例；RA组30例患者，年龄(30.1±5.9)岁，男12例、女18例；HV组30名，年龄(27.4±6.2)岁，男17例、女13例。3组研究对象的年龄和性别构成比较差异无统计学意义(P均>0.05)。
二、PBMC中踝蛋白1的蛋白表达水平比较
在CD14+单核细胞及CD3+T细胞中，AS组踝蛋白1的MFI值均高于HV组及RA组 (P均＜0.05) ，而HV组与RA组间比较差异均无统计学意义 (P均>0.05) ，见表1。
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表1 AS、HV与RA的PBMC中踝蛋白 1 MFI值的比较(±s)
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三、PBMC中踝蛋白1 mRNA表达水平比较
AS组、HV组及RA组PBMC中踝蛋白1 mRNA的相对表达水平分别为1.37±0.22、0.26±0.05及0.27±0.06，3组间比较差异有统计学意义(F=536.948，P＜0.001)，AS组PBMC中踝蛋白 1 mRNA的相对表达水平明显高于HV组(q=37.70，P＜0.05)及RA组(q=37.36，P＜0.05)，而RA组与HV组比较差异无统计学意义(q=0.34，P>0.05)，见图1。
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图1 AS、HV与RA组间PBMC中踝蛋白1 RT-PCR检测结果 A：踝蛋白1及内参GAPDH mRNA在PBMC中的表达情况，其中M为标记物、泳道1~4为AS患者、泳道5~8为HV个体、泳道9~12为RA患者；B：3组研究对象踝蛋白 1 mRNA定量结果 |
AS是一种以中轴关节受累为特征的慢性炎症性风湿病，其发病机制仍未清楚。有研究表明其发生、发展与自身炎症或免疫系统功能异常有关[5, 6]。多项研究表明，单核细胞及其分泌的细胞因子在AS发病过程中起关键作用[7, 8]。AS的主要临床症状是慢性炎症反应，但免疫细胞在其发病过程中的作用日益受关注，研究表明，抑制T细胞反应可以提高TNF-α拮抗剂对AS的疗效[9]。淋巴细胞在AS发病机制中发挥重要作用[10]。但其具体机制尚未明确。本研究探讨了AS、RA及HV中踝蛋白1在单核细胞、淋巴细胞的表达是否存在差异。
整合素家族是一组介导细胞间及细胞与ECM间相互作用的受体，它们不仅可识别细胞外环境，将信号传到细胞内，还可经胞内的信号调节其与配体的亲和力，这个过程也称为整合素的活化。它们参与了细胞增殖、迁移、凋亡与信号传导等生命活动的调节。严重的整合素结构改变及整合素通路异常，可导致细胞功能的改变乃至疾病的发生。整合素参与了炎症细胞的活化与迁移[10, 11, 12]。Van Damme等[13]研究显示，AS患者肠黏膜T细胞中整合素αEβ7表达增高。许多研究表明，整合素参与RA、AS疾病的发生及发展过程[14, 15, 16]。
踝蛋白1是整合素的一个重要配体，是免疫细胞踝蛋白的关键部分，在整合素介导细胞黏附过程中起关键作用。其通过与其胞内亚单位结合从而参与整合素通路的活化。在炎症细胞因子刺激下，白细胞表面的整合素受体由静止构象转换为活性构象，促使其活化并向炎症区域迁移，参与炎症性疾病的病理生理过程[17, 18]。AS是一类慢性炎症性疾病，其发生、发展机制虽未完全明确，但整合素在其发病过程中的作用日益受关注。本研究通过基因及蛋白水平检测表明AS患者中踝蛋白1表达明显高于HV，提示踝蛋白1在AS发生、发展过程中起重要作用。
AS与RA是本质不同的两种疾病，但AS与RA在临床表现、病理过程及病变部位上，均存在交叉及相似的地方，对于某些早期或不典型病例，有时临床上也难以鉴别。因此，本研究中除了设立HV对照组外，同时用RA患者作为疾病对照组，以了解AS与RA患者间蛋白表达差异的情况。结果显示，在RA患者中并未发现踝蛋白1表达增高，说明AS与RA炎症的产生可能是通过不同的信号通路调节的，踝蛋白1可能是AS潜在的、具有较高特异性的疾病标志物，经进一步证实后既有可能为AS的发病机制提供新的理论依据，也有可能作为AS特异的诊断指标，用于AS的早期诊断及鉴别诊断。
综上所述，踝蛋白1在AS患者PBMC中的表达水平明显高于HV及RA患者，提示踝蛋白1可能在AS发病及炎症活动过程中起重要调节作用，但其与踝蛋白1的内在联系尚需继续深入探讨。
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