免疫抑制剂治疗再生障碍性贫血(AA)取得成功证实了其为自身免疫性疾病；骨髓增生异常综合征(MDS)与急性髓系白血病(AML)虽然均为起源于骨髓造血干/祖细胞的恶性克隆性疾病，但部分MDS患者对免疫抑制剂治疗有效，而AML却只能通过放射治疗、化学治疗获得一定的临床疗效^{[1, 2]}。AA、MDS及AML三者的免疫系统发生了怎样的变化？T淋巴细胞介导的细胞免疫是否存在差异^[3]？从免疫学角度分析 AA和MDS有何质的差别？为何只有部分MDS患者对免疫抑制治疗有效？哪部分患者适合接受免疫抑制治疗？MDS和AML是两种截然不同的疾病，还是同一种疾病的不同分期？上述所有问题目前均无定论。此前笔者曾于T淋巴细胞亚群的数量及各亚群特异性转录因子水平方面探讨了三者T淋巴细胞免疫状态的异同^{[4, 5]}。本课题组应用流式细胞微球芯片捕获技术(CBA)检测AA、MDS和AML患者外周血主要参与辅助性T 淋巴细胞(Th)1和Th17细胞分化和活化的造血负调控因子IFN-γ、 TNF-α和IL-17以及主要参与Th2细胞活化的IL-4的表达水平的变化并作对比分析,从细胞因子水平探讨3种疾病的细胞免疫功能状态及其与疾病发生、发展的关系，为不同疾病、甚至同一疾病的不同阶段的治疗策略提供客观依据。

一、研究对象

2014年3月至2015年6月在山东大学附属省立医院血液科住院的AA、MDS和AML患者60例作为研究对象，所有患者均符合AA、MDS或AML的诊断标准^{[6, 7, 8]}。其中AA组20例，男12例、女8例，年龄39(20～71)岁，病程2.5(1～5)个月；MDS组20例，男14例、女6例，年龄49(13～74)岁，病程3(2～5)个月，其中难治性贫血(RA，早期阶段MDS)10例，难治性贫血伴原始细胞增多(RAEB，晚期阶段MDS)10例；AML 组20例，男13例、女7例，年龄56(15～73)岁，病程1.5(0.5～3)个月。正常对照组10名，为同院同期的非血液病健康体检者，其中男6例、女4例，年龄45(33～66)岁。本研究经山东大学附属省立医院伦理委员会批准，所有入选者均签署知情同意书。

二、试剂与仪器

购于美国BD公司的Human Th1/Th2/Th17(产品编号560484，置于4℃冰箱保存)。美国BD公司的LSRFortessa型流式细胞仪。B120型低速自动平衡离心机。

三、方 法

采用CBA检测研究对象外周血T淋巴细胞相关细胞因子的表达水平，步骤包括：①采用促凝管抽取研究对象外周血5 ml。②将外周血用150 g高速离心5 min后取上清液200 μl置于EP管存放于-80℃冰箱冻存。③实验当日将冻存的标本置于室温解冻2 h，按试剂说明书处理标本，应用标准品制作标准曲线；混合捕获免疫微球，按1∶ 4比例稀释血清样本，将捕获免疫微球和血清样本混合重悬加入藻红蛋白检测试剂后于室温下避光孵育3 h，调整好流式细胞仪，上机获取细胞。将上述采集到的数据经 BD CBA FCAP分析软件处理，得到所需细胞因子IL-4、IL-17、TNF-α和IFN-γ的表达水平。

四、统计学处理

采用SPSS 17.0软件处理数据,正态分布数据以±s表示，组间比较采用方差分析，P＜0.05为组间差异具有统计学意义，差异具有统计学意义后再采用LSD-t检验行两两比较。

一、多组间方差分析结果

各指标各组间总体比较差异均有统计学意义，IL-17、IL-4、TNF-α和IFN-γ的F值分别为6.637、5.631、7.655和6.808，P均＜0.001。

二、AA组、MDS-RA组、MDS-RAEB组及AML组与正常对照组比较情况

AA 组IFN-γ、TNF-α、IL-17表达水平均较正常对照组高(P均＜0.05)，2组IL-4表达差异则无统计学意义(P＞0.05)；MDS组IL-4和IFN-γ表达水平均较正常对照组高(P均＜0.05)，2组IL-17、TNF-α表达水平差异则无统计学意义(P＞0.05)；MDS-RA组IFN-γ和IL-17表达水平均较正常对照组高(P均＜0.05)，2组IL-4表达水平差异则无统计学意义(P＞0.05)，MDS-RA组TNF-α表达水平虽较正常对照组稍高但差异无统计学意义(P＞0.05)；MDS-RAEB组和AML组的IL-4表达水平均较正常对照组高(P均＜0.05)，3组IFN-γ、TNF-α和IL-17表达水平差异则无统计学意义(P＞0.05)。

三、MDS组与AA、AML组比较情况

与AA组比较，MDS组TNF-α表达水平较低(P＜0.05)，2组其余细胞因子表达水平差异无统计学意义(P均＞0.05)；与AML组比较，MDS组TNF-α、IFN-γ和IL-17表达水平均较高(P均＜0.05)，2组IL-4表达水平差异无统计学意义(P＞0.05)。

四、AA组、MDS-RA组、MDS-RAEB组及AML组间比较情况

与AA组比较，MDS-RA组4种细胞因子表达水平与其比较差异均无统计学意义(P均＞0.05)，而MDS-RAEB组和AML组IFN-γ、IL-17和TNF-α表达水平均较低(P均＜0.05)，但IL-4表达水平均较高(P均＜0.05)；与MDS-RA组比较，MDS-RAEB组和AML组IFN-γ、TNF-α和IL-17表达水平均较低(P均＜0.05)，而IL-4表达水平均较高(P均＜0.05)；MDS-RAEB组与AML组间4种细胞因子表达水平比较差异均无统计学意义(P均＞0.05)。

各细胞因子的表达水平见表1。

表1()

表1 各组IL-17、IL-4、TNF-α和IFN-γ的表达水平(±s) pg/ml 组 别 IL-17 IL-4 TNF-α IFN-γ AA组 31.611±6.992 9.772±0.734 6.997±0.273 10.787±0.410 MDS组 29.028±4.621 9.930±0.541 6.721±0.318 10.603±0.329 MDS-RA组 32.303±3.381 9.497±0.391 6.907±0.261 10.815±0.272 MDS-RAEB组 25.553±2.984 10.383±0.245 6.535±0.259 10.395±0.549 AML组 25.481±2.708 10.213±0.382 6.505±0.303 10.236±0.386 正常对照组 28.187±3.134 9.452±0.642 6.704±0.217 10.254±0.567

表1 各组IL-17、IL-4、TNF-α和IFN-γ的表达水平(±s)

众所周知，IFN-γ和TNF-α是Th1细胞分泌的代表性细胞因子，而IL-4、IL-17分别是Th2和Th17细胞分泌的代表性细胞因子。本实验结果显示，与正常对照组相比，AA组IFN-γ、IL-17、TNF-α的表达水平较高，而两者IL-4表达水平比较差异无统计学意义，即AA患者Th1、Th17细胞相关的细胞因子表达水平升高，而Th2细胞相关的细胞因子表达水平与正常人比较无明显差异，提示AA患者Th1/Th2平衡向Th1方向偏移，这与大多数研究的结论相一致，证实了AA表现为Th1和Th17型优势的免疫应答^{[9, 10, 11]}。

李云^[12]认为MDS患者Th细胞平衡向Th2方向极化，而Ge等^[13]和Serio等^[14]则认为MDS患者Th细胞平衡向Th1和Th17偏移。分析上述研究，可以发现前者的病例组成以MDS-RAEB患者为主，而后两者则均以MDS-RA患者为主。本研究结果显示，与正常对照组相比，MDS组IL-4和IFN-γ表达水平较高，进一步的MDS分组分析结果显示，与正常对照组相比，MDS-RA患者IFN-γ和IL-17表达水平较高，MDS-RAEB患者IL-4的表达水平较高，这与多项研究结果相符^{[4, 5, 15]}。MDS-RA与MDS-RAEB组间IFN-γ、TNF-α、IL-17、IL-4的表达水平均存在差异。提示不同阶段MDS患者的T淋巴细胞免疫状态并不相同。

目前，AA被认为是一种与免疫密切相关的、主要由T淋巴细胞介导的具有器官特异性的自身免疫性血液系统疾病，学者们普遍认为其属良性疾病，另外，部分AA患者可有染色体的异常，且约有4% ～11%的AA患者有异常克隆的表达。MDS是骨髓造血干/祖细胞的恶性克隆性疾病，MDS与AA均可引起造血功能异常，从免疫学角度如何理解两者之间的关系，目前尚无定论。本研究结果显示，与正常对照组相比，AA组与MDS-RA组造血负调控因子IFN-γ和IL-17表达水平均较高；AA组与MDS-RA组比较，4种细胞因子表达水平差异均无统计学意义，提示两者的T淋巴细胞免疫状态并无质的差异，均处于机体免疫系统对抗原识别和清除的状态，即提示AA和早期阶段MDS(MDS-RA)患者Th1和Th17细胞介导的细胞凋亡过度可能是疾病发生、发展的主要原因，这也解释了为何免疫抑制剂对部分MDS患者有效。

关于MDS-RAEB与AML的区别，从法美英合作组分类的幼稚细胞为30%到WHO分类的20%即可略见一斑，提示MDS-RAEB与AML的关系更倾向于量变引起的进展而非质变引起的转化。我们的研究结果显示，MDS-RAEB组与AML组造血负调控因子IFN-γ、IL-17和TNF-α的表达水平与正常对照组比较无明显差异，而IL-4的表达水平却高于正常对照组；MDS-RAEB组与AML组间4种细胞因子的表达差异均无统计学意义，提示两者的细胞免疫状态相似，即Th1/Th2平衡均向Th2方向偏移，Th2型细胞因子占优势，机体免疫功能受到抑制，而免疫功能抑制又与肿瘤进展互为因果，此时免疫抑制剂治疗无效，仅能通过化学治疗或放射治疗获得疗效。

综上所述，AA、不同阶段MDS和AML患者的T淋巴细胞免疫状态是不同的，AA 和早期阶段MDS，造血负调控细胞因子所介导的细胞凋亡过度可能是引起造血功能异常的主要原因，但这在一定程度上抑制了恶性克隆的增殖；随着疾病进展，即在MDS晚期阶段和AML，由于抗原剂量太高诱导的免疫耐受或异常克隆进一步发展，调节体液免疫的Th2型细胞因子逐渐占据优势，导致了疾病的快速进展甚至向白血病“转化”。

致谢：感谢山东省立医院中心实验室刘晓雯老师对我的悉心帮助。衷心感谢每一位帮助我的老师！

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