深静脉血栓(DVT)是临床常见疾病，而静脉血栓形成的时间长短对治疗方案的选择意义重大[1]。如能较准确诊断早期血栓，对患者的早期治疗和治疗方案的选择有重要意义。超声弹性成像作为一种新的超声诊断技术得到了广泛关注并迅猛发展。本研究应用超声弹性成像技术对兔下腔静脉血栓模型进行检查，并研究弹性数据变化是否与血栓形成时间相关，现报告如下。
材料与方法一、实验动物
清洁级雄性新西兰大白兔20只，体质量 2.5~3.0 kg，由广东省实验动物中心提供。适应性喂食标准饲料1周后，记录大白兔等基本资料。本实验由广州市第一人民医院伦理委员会监督，符合动物保护、动物福利和伦理原则，符合国家实验动物福利伦理的相关规定。
二、分 组
动物按随机数字表法分为4组：A组(对照组，n=5)，假手术法建模，超声检查后处死；B组(急性组，n=5)，建立下腔静脉血栓模型，7 d后超声检查并处死；C组(亚急性组，n=5)，建立下腔静脉血栓模型，21 d后超声检查并处死；D组(慢性组，n=5)，建立下腔静脉血栓模型，3个月后超声检查并处死。
三、主要试剂
凝血酶购自北京康辰药业有限公司，每瓶1 U；10%苯巴比妥钠购自广东邦民制药厂有限公司，1 ml∶ 0.1 g。
四、实验方法
1. 造模方法
假手术法建模：耳缘静脉注入10%苯巴比妥钠1 ml/kg静脉麻醉，确认麻醉效果后开腹，游离下腔静脉(左肾静脉与下腔静脉汇合处至髂总静脉分叉处)后不结扎，关腹结束手术。
下腔静脉血栓模型：耳缘静脉注入10%苯巴比妥钠1 ml/kg静脉麻醉，确认麻醉效果后开腹，游离下腔静脉(左肾静脉与下腔静脉汇合处至髂总静脉分叉处)，分别在左肾静脉汇合下腔静脉处下方及髂总静脉分叉处上方用 1号丝线结扎下腔静脉，并注入凝血酶0.1 U/kg，经25 G 细针穿刺无血液流出，证实该段静脉内血栓已形成[2]。
2. 超声弹性成像技术检查方法与观察指标
建立下腔静脉血栓模型7 d(B组)、21 d(C组)、3个月(D组)后使用HITACHI公司AVIUS数字化彩色多普勒超声波诊断仪分别对A组、B组、C组、D组的兔下腔静脉进行检查并评估，使用L74M线阵探头，频率5～13 MHz。大白兔经麻醉脱毛后取仰卧位固定在固定板上，首先用探头在腹腔加压扫查，用常规超声扫查下腔静脉并取静脉长轴切面观察血栓所在位置。进行超声弹性成像检查时应调整取样框大小为感兴趣血管内径的2~3倍，探头垂直于腹壁表面做快速微小震动，综合数字指标应控制在3～4，观察取样框内颜色变化并进行评估，弹性图像以彩色编码代表不同的组织弹性程度，从软至硬分别为红色、黄色、绿色、蓝色[3]。
3. 组织学检查
在超声弹性成像技术检查4组兔下腔静脉或下腔静脉血栓后处死动物，剪取下腔静脉，10%中性甲醛固定，梯度乙醇脱水12 h后，石蜡包埋，以4 μm厚度切片、铺片、脱蜡后，常规苏木素-伊红染色观察。
五、统计学处理
使用SPSS 18.0软件包对实验数据进行分析。等级资料的组间比较采用秩和检验。B、C、D组总体比较以P<0.05为差异有统计学意义，进一步两两比较比较采用Bonferroni法校正检验水准，即P<0.05/3=0.017为差异有统计学意义。
结 果一、组织学检查结果
A组(对照组)解剖后下腔静脉内未见血栓形成。B组(急性组)血栓病理显示为新鲜的混合血栓，显微镜下可见淡红色血小板小梁网、大量红细胞充填其间，血管腔几乎被堵塞，红细胞分布于小梁间(图1A)。C组(亚急性组)血栓在显微镜下显示混合型血栓脱水回缩、开始与血管壁分离(图1B)。D组(慢性组)血栓病理显示为陈旧性混合血栓，显微镜下见血栓进一步回缩，纤维母细胞、血管内皮细胞长入血栓内，局灶见肉芽组织形成，呈部分机化改变(图1C)。
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图1 B、C、D组兔下腔静脉血栓形成的组织学检查结果(苏木素-伊红染色，×400) A：B组，急性血栓形成；B：C组，亚急性血栓形成；C：D组，慢性血栓形成，黑色箭头示肉芽组织形成 |
二、超声弹性成像检查结果 在超声弹性成像技术检查时，A组(对照组)中下腔静脉内均显示以红色为主(5/5)，B组(急性组)中下腔静脉血栓显示以绿色为主(4/5)，C组(亚急性组)中下腔静脉血栓显示以蓝色为主(4/5)，D组(慢性组)中下腔静脉血栓显示以蓝色为主(5/5)，见图2及表1。根据评估取样框内颜色变化，对各组血栓图像进行比较，多组独立样本资料的秩和检验结果显示，B、C、D组下腔静脉血栓显色色度不尽一致(H=10.907，P<0.01)；进一步两两比较显示，B组下腔静脉血栓显色色度分别与C组、D组比较差异有统计学意义(Z分别为10.224、11.660，P均<0.017)，C、D组间下腔静脉血栓显色色度比较差异无统计学意义(Z=0.220，P=0.639)。
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图2 各组下腔静脉行超声弹性成像技术检查 A：A组，正常对照；B：B组，急性血栓形成；C：C组，亚急性血栓形成；D：D组，慢性血栓形成 |
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表1 超声弹性成像技术评估结果 |
DVT由缓慢血流、损伤静脉壁和血液高凝状态等主要因素引起[4]。根据血栓形成的时间长短可以分为：①急性血栓，指血栓初步形成至1～2 周内，由血小板、红细胞为主要成分，通常与静脉壁附着不紧密，易于脱落，但是此时期溶栓药物可打破血小板网，故治疗效果较好；②亚急性血栓，指血栓形成数周以后，通常血栓开始慢慢溶解，逐步缩小、吸收，原来梗阻后扩张的深静脉管径也随之回缩，部分腔内可能有血流通过；③慢性血栓，急性血栓发作后数月至数年的血栓[5]。随着时间推移，血栓逐渐发生机化，纤维母细胞和血管内皮细胞逐渐成为血栓的主要成分，血凝块质地变硬，与血管壁牢固黏附，不再有脱落的危险，但是不能自行溶解，大部分溶栓治疗无明显效果，报道称DVT中仅20%能完全溶解[6]。如能及时判断静脉血栓形成的时间长短，特别是急性期，对临床选择治疗方案有重要意义。
现阶段临床评估静脉血栓的方法主要有：①临床评估，Wells等在1995年提出了DVT发生可能性的临床评估模式，根据合并肿瘤、瘫痪、局部麻痹或近期肢体制动、近期卧床＞3 d或大手术后4周内、沿深静脉走行的局限性压痛、下肢全程肿胀、限于患肢的凹陷性水肿、限于患肢的浅静脉显现(除外静脉曲张)等方面评估疑似患者发生DVT的可能性，并分为低、中、高3种，这种方法主要用于筛选可疑病例；②彩色多普勒超声，通过高分辨率的高频超声加上增压和多普勒血流频谱对血管进行扫描是现在临床首选的检查方式，对于近心端血栓诊断率很高，但并不能对血栓形成时间的长短进行初步评估；③D-二聚体检测，D-二聚体是血栓形成过程中产生的一种交联纤维蛋白降解产物，其升高的原因有DIC、血栓形成、继发性纤维蛋白溶解、肿瘤、创伤等，所以D-二聚体检测通常合并临床评估模式用于筛查可疑DVT；④放射、核素和MRI，静脉造影属于现阶段DVT诊断金标准，但属于有创检查，并发症有造影剂过敏等，甚至会诱发或者加重DVT，非手术患者不作为常规选用，CT、螺旋CT、PET对于新鲜血栓阳性率高，对于陈旧血栓阳性率较低，MRI对于盆腔静脉血栓有较好的诊断率，但对于小腿静脉血栓及无症状患者的诊断敏感度很低；⑤红外热像技术，指对人体进行红外扫描并利用采集系统接收人体辐射的红外能量，经过计算机的分析和对图像进行处理，形成以不同的颜色显示人体温度分布的红外热像图，通过定量分析温度的变化判断某些病灶的位置与性质[7]。目前，已有红外热像技术应用于下肢血管疾病的研究报道，目前该技术尚处于研究阶段[8]。
以上几种方法在评估静脉血栓方面均有其局限性，特别在判断静脉血栓形成时间方面。根据 Dhamarajah等[9]报道，血栓组织随着时间的增加、成分的改变，形成一个由软到硬的逐渐发展的过程。急性血栓是混合血栓，成分为纤维蛋白和血细胞，相对较软。随着时间增加，血栓内成分发生改变，纤维蛋白和胶原成分逐渐增多，硬度开始逐步加大。因此，我们可以通过超声弹性成像技术评估血栓组织各个阶段的变化。超声弹性成像的概念在1991年由Ophir等率先提出，自此超声弹性成像就受到了各界学者的广泛关注并迅速发展[10]。超声弹性成像技术目前主要分为以下3种：①压迫性弹性成像；②瞬时弹性成像；③振动性弹性成像[11]。其中压迫性弹性成像是利用外部或内部的压力源对组织施加一个动态或者静态、准静态的刺激，组织会对刺激产生如应变、速度分布、位移等方面的变化。较硬的组织相对较软的组织所产生的改变会较小。通过计算机对信号进行处理，然后不同组织的弹性系数在显示器上通过不同的颜色显示[12]。该超声弹性技术的代表机型主要是日本HITACHI公司开发的各种型号的超声弹性成像设备。本研究使用的就是此类设备。
本研究提示，急性与亚急性和慢性期血栓的超声弹性成像检查结果存在差异，但亚急性和慢性期血栓的检查结果接近。急性血栓的准确诊断，对患者的早期治疗和治疗方案的选择意义重大。上述结果提示，超声弹性成像技术对于初步估测血栓分期具有一定价值，该技术有助于临床对患者静脉血栓分期估测，具有一定临床价值。鉴于本研究为动物实验，且实验动物较少，研究结果尚待进一步大样本量研究及临床研究证实。
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