众所周知，骨折最常见的并发症是骨折的延迟愈合及不愈合[1]。李冀等[2]的调查显示，骨折不愈合在骨折术后并发症中的发生率高达10％。骨折不愈合的原因不仅是最初的高能量创伤所致的骨与血管的损伤，骨折的治疗方式也是其中之一[3]。虽然现在骨折的治疗水平越来越高，但骨折不愈合的治疗却仍是一个棘手的难题。其中萎缩型骨折不愈合因其骨折断端血运差，缺少成骨活性，治疗更加困难[4]。近几年出现的新技术——“手风琴技术”为萎缩型骨折不愈合的治疗打开了一扇新的大门[5]。由于相关的基础实验需依靠模型才能进行，因此，对于骨折不愈合的研究，制作一种可靠的实验动物模型势在必行的。
目前关于利用兔股骨制作骨折不愈合模型的研究尚少。根据Schmize等的结论，造成相当于长骨骨干直径的1.5～2.5倍以上或其长度的1/10以上的骨缺损即可造成骨折不愈合模型[6]。Chaubey等[7]和郭树章等[8]均利用新西兰大白兔进行过骨折不愈合模型的研究，证明利用兔制作该模型具有可行性。但以上所介绍的兔模型均使用兔桡骨作为造模部位，同时使用内固定方式造模，我们则应用较桡骨更长、直径更大的股骨造模，因造模部位范围的增大，造模过程的难度降低，同时，我们应用单边可调节外固定架对骨缺损部位进行固定，其可通过调节两导针的距离来微调骨缺损部位的距离，较内固定方式更灵活，现将实验结果报告如下。
材料与方法一、材 料
选取82只4～6月龄、体质量1.5～2.5 kg的雄性新西兰大白兔作为骨折不愈合造模实验动物，实验动物由北京金牧阳实验动物有限公司提供。所有实验动物于清洁环境下分笼饲养于承德医学院附属医院实验动物中心，自由活动。所有对实验动物的操作均符合动物伦理学要求。
二、模型制造
1. 实验动物分组
选取10只大白兔，应用空气栓塞法将其处死，用电动褪毛器将其双下肢褪毛，然后分离双侧股骨软组织，离断髋、膝两关节，获得完整的股骨标本，对10只大白兔的股骨长度及股骨中段直径指标进行测量并记录(表1)。然后将剩余的72只大白兔随机分为3组各24只，分别设为15 mm缺损组、10 mm骨蜡缺损组及10 mm缺损组，3组月龄及体质量比较差异均无统计学意义，P均＞0.05(表2)。
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表1 10只大白兔股骨标本测量数据 |
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表2 15 mm缺损组、10 mm骨蜡缺损组及10 mm缺损组月龄及体质量比较 |
2. 非感染性骨折不愈合造模
根据文献 [8, 9, 10]的方法制作兔股骨非感染性骨折不愈合模型。取3组大白兔左腿为实验侧，术区用电动褪毛器褪毛。术前常规肌内注射青霉素40万单位预防感染。使用3%戊巴比妥钠按 1.0 mg/kg的剂量注入大白兔耳缘静脉将其麻醉后侧卧于兔台上，保持其呼吸道通畅，用0.5%碘伏消毒褪毛区，常规铺无菌手术单。取大腿中部外侧纵形切口，逐层分离软组织，最大程度避免损伤软组织，于股外侧肌和股后肌之间的肌间隔行钝性分离，充分暴露股骨干。分别于股骨远端及近端平行放置2枚1.5 mm单边可调节外固定架螺纹钉，然后安装单边可调节外固定架(图1A～F)，确保其 固定牢固。用线锯在股骨中段截骨，15 mm缺损组制成15 mm的骨缺损，不用骨蜡封堵； 10 mm骨 蜡缺损组制成10 mm骨缺损，并用骨蜡封堵髓腔；10 mm缺损组制成10 mm的骨缺损，不用骨蜡封堵(图1G～H)。于截骨过程中反复用生理盐水冲洗截骨处，避免截骨周围骨膜及软组织因线锯截骨产热而受损。然后彻底止血，用生理盐水及5%碘伏反复冲洗手术伤口后缝合、包扎。术后于清洁级环境下分笼饲养大白兔，肌内注射青霉素40万单位/日共1周，并用5%碘伏消毒伤口2次/日，常规换药预防感染。8周后对3组行X线检查，然后将其处死，截取骨折断端骨痂软组织，行苏木素-伊红(HE)染色，于显微镜下400倍视野进行组织学观察。
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图1 采用单边可调节外固定架制作兔股骨非感染性骨折不愈合模型 A：单边可调节外固定架；B：固定术区；C：取股骨外侧切口；D：充分显露股骨；E：安装单边可调节外固定架；F：15 mm缺损组截骨长度(图中标尺最小刻度均为mm)；G：10 mm骨蜡缺损组截骨长度；H：10 mm缺损组截骨长度；I：术后自由活动的实验动物；J：15 mm缺损组术后8周X线片；K：10 mm骨蜡缺损组术后8周X线片；L：10 mm缺损组术后8周X线片；M：15 mm缺损组术后8周病理组织学检查图示无骨性连接，为纤维组织(HE，×400)；N：10 mm骨蜡缺损组术后8周病理组织学检查图示无骨性连接，为纤维组织(HE，×400)；O：10 mm缺损组术后8周病理组织学检查图示软骨细胞向骨细胞转化(HE，×400) |
三、统计学处理
采用 SPSS 19.0 统计软件包分析数据。分类资料用率描述，其中等级资料组间比较采用秩和检验，无序分类资料组间比较采用χ2检验，组间两两比较采用Bonferroni法校正检验水准，α′=0.05/3。
结 果一、大体观察
15 mm缺损组1只大白兔因麻醉意外死亡，10 mm骨蜡缺损组1只大白兔螺钉松动脱落，10 mm骨蜡缺损组及10 mm缺损组各有1只大白兔感染，均排除，即最终15 mm缺损组有23只大白兔、10 mm骨蜡缺损组有22只大白兔、10 mm缺损组有23只大白兔纳入统计。纳入统计的大白兔术后均可自由活动，3 d后恢复术前状态，步态无异常(图1I)。实验期间，3组均正常健康生长，单边可调节外固定架固定牢固(图1J～L)。
二、X线检查
术后8周，15 mm缺损组22只(95.7%)、10 mm骨蜡缺损组20只(90.9%)、10 mm缺损组10只(43.5%)的X线检查结果符合骨折不愈合表现(图1J～L)，3组骨折不愈合率总体比较的χ2=21.17，P＜0.001。与10 mm缺损组比较，15 mm缺损组及10 mm骨蜡缺损组的骨折不愈合率均较高(χ2值分别为14.786及11.383，P均＜0.001)，可见2组制模效果均优于10 mm缺损组。15 mm缺损组与10 mm骨蜡缺损组间骨折不愈合比较差异无统计学意义(χ2=0.407，P=0.608)，可见2组的制模效果相当。
三、病理组织学检查
术后8周时，10 mm缺损组骨缺损区有大量的软骨向新生骨转化，连接骨缺损区，与自身骨组织有很好的融合。15 mm缺损组及10 mm骨蜡缺损组骨缺损区无骨性连接，由肉芽瘢痕充填，髓腔封闭(图1M～O)。
讨 论本研究结果示，以新西兰大白兔为实验动物时，造成相当于长骨骨干直径的1.5～2.5倍以上或其长度的1/10以上的骨缺损并不能完全保证制造骨折不愈合模型成功，但造成相应倍数的骨缺损后于骨折断端填充骨蜡或造成1.5 mm的骨缺损却可以成功造模。
一、实验动物的选择
对于现阶段的临床治疗来说，新理念或者新技术的引进均需要经过前期的大量基础实验来证明其疗效，因此，实验动物模型的建立必不可少。与大型动物比如犬类相比，新西兰大白兔更容易饲养及控制，具有更好的实验操作性。而且相较大型动物，新西兰大白兔更多地被应用于动物实验研究，因此有统一的饲养模式。同时新西兰大白兔的成本较大型动物低得多。就本类实验来讲，新西兰大白兔与大鼠相比，股骨长度相对较长，手术操作性更强，更加容易控制骨缺损的长度，因此新 西兰大白兔非常适合作为制造骨缺损模型的实验动物[11]。
二、固定方式的选择
关于造模过程中的固定方式仍值得商榷，以往的研究者们经常采用克氏针进行髓内固定或者微型钢板进行内固定，但这些固定方法的抗旋转能力均差，由于实验动物术后自由活动，过度的活动会因内固定的抗旋转能力差而导致骨折断端旋转微动，造成局部血运受到破坏，增加实验的干扰因素。我们应用的单边可调节的固定方式具有较强的抗旋转能力，可牢固固定，因此对局部血运影响不大，而且只固定局部，不影响关节，实验动物可以自由活动。
三、造模部位的选择
我们选用股骨作为实验骨，因股骨较其他长骨长度更长，直径更大，充分显露股骨后可以提供一个较其他部位更加明显的术野及宽敞的空间，更利于手术操作的进行。放置单边可调节外固定架时，应尽量保证4根螺钉平行于一个平面内。由于兔股骨相对于外固定架来讲仍较细，因此选用1.5 mm的螺钉，避免兔股骨骨皮质劈裂、单边可调外固定架脱落等。
四、骨缺损长度的确定
我们是在对处死大白兔股骨测量并记录后进行统计学分析确定骨缺损长度的，兔股骨直径分布符合正态分布，平均值为5.3 mm。根据Schmize等得出的结论，造成相当于长骨骨干直径1.5～2.5倍以上或其长度的1/10以上的骨缺损即可造成骨折不愈合，按此本实验的截骨范围为7.95 mm～13.25 mm，再参考彭吾训等[12]及Lin等[13]的研究，他们曾制作过兔长骨15 mm的骨缺损模型，故本实验综合2种结论，制作了10 mm及15 mm的骨缺损模型。笔者除了探究骨缺损长度对骨折不愈合造模的影响外，还考虑到对骨折断端填充骨蜡后是否会对造模存在影响，故再制作了10 mm骨蜡缺损组，最后证明填充骨蜡有利于骨折不愈合模型的建立。综上所述，15 mm组不需骨蜡填充也能成功造模，而10 mm缺损组则要用骨蜡填充才能制模成功。
综上所述，本实验成功建立了15 mm缺损组与10 mm骨蜡缺损组2种兔股骨非感染性骨折不愈合模型，采用单边可调节外固定架建立这2种模型是可行的。
| [1] | 邢丹,马信龙,宋东辉,马剑雄,徐卫国,王杰,杨阳,陈阳.长骨骨折愈合力学环境的研究现状. 生物医学工程与临床, 2012, 16(6): 602-606.( 1) |
| [2] | 李冀,赵伟超,关鹏飞,王舒新,葛欣昌,焦翔,陈长河. 长骨医源性骨不连的临床流行病学调查. 中国骨与关节损伤杂志, 2012, 27(1): 34-36.(1) |
| [3] | Zhang M, Wang GL, Zhang HF, Hu XD, Shi XY, Li S, Lin W. Repair of segmental long bone defect in a rabbit radius nonunion model: comparison of cylindrical porous titanium and hydroxyapatite scaffolds. Artif Organs,2014, 38(6): 493-502. (1) |
| [4] | 赵震宇,邵林,刘建宇,杨大平,郝晨光,韩剑锋,赵洪梅,刘国锋.微型外固定器制作大鼠股骨萎缩型骨不连模型的实验研究. 中华创伤骨科杂志, 2011, 13(3): 261-264.(1) |
| [5] | 马忠超,王佰亮,许艳旭,王玮玮. 改良多功能外固定支架和交锁髓内钉治疗胫腓骨 C 型骨折的疗效对比研究. 新医学, 2014,45(10): 691-694.(1) |
| [6] | 张凤鸣, 闫石,张万东. 兔股骨骨不连模型的建立. 医学信息, 2015,28 (14):132. (1) |
| [7] | Chaubey A, Grawe B, Meganck JA, Dyment N, Inzana J, Jiang X, Connolley C, Awad H, Rowe D, Kenter K, Goldstein SA, Butler D. Structural and biomechanical responses of osseous healing: a novel murine nonunion model. J Orthop Traumatol, 2013, 14(4): 247-257. (1) |
| [8] | 郭树章,季明华,许刚,张文举,徐斌.兔骨折延迟愈合动物模型的建立. 实用骨科杂志, 2012, 18(3): 230-232.(2) |
| [9] | 王永刚,裴国献,张洪涛,张元平,王学明.兔股骨干缺损模型的制备及在组织工程骨实验中的应用. 中华创伤骨科杂志, 2005, 7(10): 971-974. (1) |
| [10] | 赵震宇,邵林,刘建宇,杨大平,郝晨光,赵洪梅.外固定方法制作的大鼠股骨骨折模型. 中国组织工程研究, 2011, 15(24): 4387-4390.(1) |
| [11] | 陈连旭,余家阔,于长隆,王海军,恭喜,王建,谢兴. 大鼠, 兔和人关节软骨组织形态学的比较. 中国组织工程研究与临床康复, 2007, 11(41): 8230-8233.(1) |
| [12] | 彭吾训,王蕾,邓进,李彦林,龚跃昆,李世和.一种组织工程骨修复兔股骨头坏死模型的效果评价. 第三军医大学学报, 2010, 32(7): 661-664.(1) |
| [13] | Lin K, Liu Y, Huang H, Chen L, Wang Z, Chang J. Degradation and silicon excretion of the calcium silicate bioactive ceramics during bone regeneration using rabbit femur defect model.J Mater Sci Mater Med,2015,26(6):197. (1) |