529000 江门，江门市五邑中医院检验科 (申旺)
肝癌是常见的恶性肿瘤之一。全世界每年大约43.7万人被诊断为肝癌，其中约50%的肝癌发生在中国[1, 2]。流行病学和实验室研究表明，肝癌的主要病因有HBV、丙型肝炎病毒 (HCV)感染和黄曲霉素B1(AFB1) 的摄入以及酗酒，而在我国HBV和HCV慢性感染是导致肝癌发生的最主要因素[3]。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3 (GPC3) 在胎儿肝脏中表达丰富，在成人肝脏中不表达，肝癌发生时被激活，通过整合素、胰岛素样生长因子和Wnt信号通路等途径促进肝癌细胞的生长[4]。本研究着重于从“肝炎-肝硬化-肝癌”逐步进展的角度，对正常肝组织和HBV或HCV感染引起的肝炎、肝硬化、肝癌组织及癌旁肝组织的GPC3进行免疫组织化学 (IHC) 分析，探讨GPC3在HBV相关性肝癌和HCV相关性肝癌发生、发展中的作用及其区别。
对象与方法一、研究对象
收集2012年8月至2015年4月在中山大学附属江门中心医院行外科手术切除并经病理学确诊且有完整临床资料的肝癌肝组织及相应的癌旁组织(距癌组织边缘2 cm的肝组织)47对，患者男40例、女7例，年龄37~72岁、中位年龄56岁。其中HBV相关性肝癌患者31例(同时合并有肝硬化23例)，HCV相关性肝癌患者16例。收集同期肝硬化手术切除或接受病理活组织检查(活检)的肝组织36例，患者男31例，女5例，年龄32~58岁、中位年龄48岁，其中HBV相关性肝硬化患者22例、HCV相关性肝硬化患者14例。收集同期穿刺的肝炎肝组织26例，患者男21例、女5例，年龄35~61岁、中位年龄50岁，其中慢性乙型肝炎(乙肝)患者18例、慢性丙型肝炎(丙肝)患者8例。同时收集12例正常肝组织(均取自外科手术切除的肝血管瘤旁组织)，患者男10例、女2例，年龄31~59岁、中位年龄43岁。该研究经本院医学伦理委员会批准，入组患者均签署病理检查知情同意书。
二、方法
采用IHC染色法检测GPC3的表达。标本经10%中性甲醛固定，石蜡包埋，制成4 μm连续切片后，放于阳离子玻片上，于烤箱中65℃ 2 h使石蜡熔化，再用Roche-Ventana公司的BenchMark XT 全自动IHC染色机染色。GPC3一抗为鼠抗人单克隆抗体，克隆号1G12，稀释度1∶ 200，一抗及抗体稀释液均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，Ultra ViewTM通用二氨联苯胺检测试剂盒和所配套试剂均购自上海罗氏诊断产品有限公司，所用程序为S3732。
三、结果判断
由2位资深病理科医师采用双盲法对染色结果进行评估。以细胞浆出现棕黄色颗粒为阳性，综合组织染色强度和阳性细胞数进行半定量法评分：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；阳性细胞百分比评分标准：阴性为0分，阳性细胞比例少于10%记1分，阳性细胞比例10%~50%记2分，阳性细胞比例51%~80%记3分，阳性细胞比例81%~100%记4分。总染色评分=染色强度评分×染色细胞百分比评分。0~1分为阴性，2~4分为低表达，5~8分为中表达，9~12分为高表达[5]。
四、统计学处理
使用SPSS 19.0统计学软件处理数据。计数资料以百分比表示，同一部位组织间比较采用配对四格表资料χ2检验，不同部位组织间比较采用成组设计四格表资料χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义，多组间两两比较用Bonferroni法校正。
结 果一、各组肝组织GPC3的表达情况分析
正常肝组织组、乙肝组、丙肝组和HBV感染肝硬化组肝组织均未见GPC3的表达；HBV和HCV感染肝癌组的GPC3阳性率与癌旁组织及其相应的肝炎组、肝硬化组肝组织比较差异均有统计学意义(P<0.001，小于校正后的检验水平0.05/4=0.012)；HBV和HCV感染的癌旁组织GPC3表达的阳性率均高于相应的肝硬化组肝组织，但比较差异均无统计学意义(P值分别为0.013、0.604，P均>0.005)；GPC3在HCV相关性肝癌、癌旁组织、肝硬化组织中的阳性率均明显高于HBV相关性肝癌、癌旁组织、肝硬化组织(P均<0.05)，见图1及表1。
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图1 GPC3在正常肝组织、HBV及HCV感染肝组织中的表达(IHC染色，A、B、D×40，C、E×200) A：HBV感染肝硬化组织，GPC3阴性；B：HBV相关性肝癌组织，GPC3阴性；C：合并肝硬化的HBV相关性肝癌组织，GPC3阳性；D：HCV感染肝硬化组织，GPC3阳性；E：HCV相关性肝癌，GPC3阳性 |
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表1 GPC3在正常肝组织、HBV及HCV感染肝组织中的表达情况 |
二、合并肝硬化的HBV相关性肝癌及癌旁组织的GPC3表达分析。
根据HBV或HCV相关性及肝癌是否合并肝硬化的情况，将肝癌和癌旁组织分为3组：HCV相关性组、HBV相关性合并肝硬化组、HBV相关性未合并肝硬化组。对3组中的肝癌、癌旁组织的GPC3阳性率进行比较，发现HCV相关性肝癌组和HBV相关性合并肝硬化组肝癌的GPC3阳性率高于无合并有肝硬化的HBV相关性肝癌(P<0.001，小于校正后的检验水平0.05/3=0.017)，而与癌旁组织的GPC3阳性率比较差异并无统计学意义(P>0.017)。见表2。
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表2 合并肝硬化的HBV相关性肝癌及癌旁组织的GPC3表达情况 |
GPC3为硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)家族成员，其核心结构包含核心蛋白、硫酸乙酰肝素(HS)链和糖基化磷脂酰肌醇(GPI)，并通过GPI锚定在细胞膜表面[6]。GPC3在胚胎及胎儿期组织器官的形成和发育阶段扮演着重要角色，主要作用是防止组织器官生长过大并在整体上调节身体大小。从出生后到成人阶段，GPC3除在胎盘、乳腺、间皮、卵巢、肺及肾组织有弱表达外，在其他正常组织无明显表达[7]。研究表明，GPC3高表达是肝癌形成过程中的早期事件，影响多种信号传导途径，经多聚阴离子GAG侧链或核心蛋白与Win、胰岛素样生长因子-Ⅱ和转化酶等共同作用，参与肝癌的发生、发展过程，并与肝细胞恶性转化关系密切[8]。本研究中，正常肝组织、HBV感染的肝炎、肝硬化组织及癌旁肝组织中GPC3均阴性表达或低表达，而在HBV相关性肝癌中有较高的阳性率(74.2%)，与卞银珠等[9]研究基本一致。研究也发现，GPC3在HCV感染的肝癌中阳性率为100%，远大于其在癌旁组织和肝硬化中的表达率，与Abdul-Al等[10]研究相符，表明GPC3在HBV和HCV相关性肝癌的诊断中都具有很高的敏感度和特异度。
本研究发现，GPC3在HCV感染的肝硬化、肝癌及癌旁组织中的阳性率均高于HBV感染组的相对应组，这也许与GPC3在HBV和HCV中的致癌机制不同有关。HBV为DNA病毒，其主要通过基因整合到宿主染色体上，HBV通过与细胞表面GPC3的GAG侧链相连进入人体细胞启动了多级HBV侵入程序[11, 12]。HCV为RNA病毒，在体内不与宿主染色体进行整合，HCV通过脂蛋白质脂肪酶与细胞表面的GPC3和其他HSPG结合，介导HCV与被膜靶细胞相互作用，并激活胰岛素样生长因子信号通道，从而使肝细胞发生恶变导致肝癌的发生[11, 13]。由于HCV相关性肝癌均经历了“肝炎-肝硬化-肝癌”的逐步发展过程，因此所有HCV感染的肝癌均同时合并有肝硬化，而一些HBV感染的肝炎可不经过肝硬化阶段直接导致肝癌的发生，故本研究进一步对合并有肝硬化的HBV相关性肝癌及其癌旁组织进行分析。研究发现，HCV相关性肝癌和同时合并有肝硬化的HBV相关性肝癌GPC3的阳性率比较差异并无统计学意义，两者与无合并肝硬化的HBV相关性肝癌中的GPC3阳性率比较差异均有统计学意义，这表明HCV和HBV相关性肝癌中的GPC3阳性率的差异与是否合并肝硬化有关，同时也提示GPC3在“肝炎-肝硬化-肝癌”的发展进程中发挥了重要的作用。
付顺军等[8]研究表明，肝癌及癌旁组织GPC3表达的强弱是影响肝癌患者术后无瘤生存率的独立危险因素。殷欣等[11]研究认为HCV相关性肝癌患者总体生存率优于HBV相关性肝癌患者，这似乎与本研究中HCV相关性肝癌及其癌旁组织GPC3的表达率高于HBV相关性肝癌相矛盾。分析原因，可能与HBV相关性肝癌患者多在出现临床症状下就诊，导致病情发现晚，肿瘤大，伴血管癌栓，肿瘤突破包膜者比例高；而HCV相关性肝癌多发于老年患者，自然病程较长，肿瘤进展较缓慢有关。未对HBV相关性肝癌和HCV相关性肝癌患者的术后生存期分别进行统计分析，这是本研究的不足之处。
综上所述，GPC3在HBV和HCV相关性肝癌组织中均高度表达，尤其是在其感染的“肝炎-肝硬化-肝癌”发展进程中发挥了重要的作用。
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