一、U251细胞培养

神经胶质瘤细胞株U251的培养参考已发表文章进行^[6]。U251细胞购自中科院上海细胞库。培养基为高糖DMEM(美国Invitrogen公司)加10%胎牛血清(美国Hyclone公司)。

二、U251细胞转染

转染参照Thermo公司的说明书，当U251细胞生长至融合度70%以上时，用Turbofect Transfection Reagent分别将质粒BS/U6、she2f1a、she2f1b转染到U251细胞内，于37℃恒温箱培养48 h。转染细胞分为3组，转染BS/U6作为对照组，2个E2F1干扰质粒为she2f1a组和she2f1b组(24孔板，每孔0.5 μg)。质粒BS/U6、she2f1a，she2f1b的靶序列参照已发表文章设计^[5]。

三、细胞加药处理

参考已发表文章进行^[6]。用胰酶消化U251细胞，种入24孔板，当细胞生长至融合度为50%～60%时，将细胞分为对照组[二甲基亚砜(DMSO,Sigma)处理]和组蛋白去乙酰化酶抑制剂组(分别用TSA、M344、NaBu、VPA处理)，分别处理8、12、24 h后进行噻唑蓝比色法分析或Hoechst 33258核染色后计数细胞数。

四、蛋白免疫印迹

参考已发表文章进行^[7]。为了检测曲古菌素A处理U251细胞后对E2F1的抑制作用是否发生在抑制细胞增殖之前，我们用曲古菌素A处理U251细胞2 h、4 h、8 h，用细胞裂解液(50 mmol/L Tris pH 7.4、150 mmol/L NaCl、2 mmol/L EGTA、1 mmol/L EDTA、1% Triton X-100、 2.5 mmol/L Sodium pyrophosphate、1 mmol/L Glycerophosphate、1 mmol/L Na₃VO₄ 、1 mmol/L PMSF、1 μg/ml Leupeptin、5 μg/ml Aprotinin)裂解细胞检测E2F1的表达。同时，用多种HDACIs如0.5 μmol/L TSA、6 mmol/L NaBu、6 mmol/L VPA、1 μmol/L SAHA、1 μmol/L M344处理U251细胞8 h后裂解细胞检测E2F1表达。用针对E2F1的小分子干扰质粒转染U251细胞48 h后裂解细胞，检测E2F1表达。采用4%集成胶和10%分离胶，200 V电压电泳45 min，100 V电压转膜60 min。脱脂奶粉(5%)室温封闭1 h。一抗(anti-E2F1 1∶1 000，anti-GAPDH 1∶5 000，所有抗体均购自美国Cell Signaling Technology公司)孵育过夜(4℃)，辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(美国Jackson Immuno Research公司)室温孵育1 h。增强化学发光后曝光。

五、噻唑蓝比色法(MTT)分析

参考已发表文章进行^[7]。用胰酶消化U251细胞，种入96孔板，每个处理为6个平行孔。只加培养液不加细胞作空白对照。为防止MTT分析时有边缘效应，板周边的孔不加细胞。当U251细胞生长至融合度为50%～60%时，转染质粒BS/U6、she2f1a、 she2f1b共48 h，每孔加入MTT溶液(5 g/L)20 μl培养4 h，弃培养液，然后每孔加入DMSO 150 μl，振荡10 min，选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定全部孔包括平行孔的吸光度A值。

六、统计学处理

检测数据采用SPSS 18.0软件包进行统计分析，定量资料用x±s表示，2组间比较采用独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析，差异有统计学意义后采用LSD-t检验或Dunnet-t检验进行两两对比。P＜0.05具有统计学意义。

一、沉默E2F1抑制U251细胞增殖

与对照相比，2个E2F1干扰质粒she2f1a和she2f1b均能抑制E2F1表达和细胞增殖(BS/U6: 增殖率=100%; she2f1a：增殖率=78±6，n=3，P=0.02；she2f1b：增殖率=83±5,n=3,P=0.03)(图 1A,B )。核染色后统计细胞数，与对照组比较，干扰E2F1组的细胞减少(BS/U6: 100%; she2f1a：增殖率=79±2,n=3，P=0.007；she2f1b：增殖率=77±6，n=3,P=0.01)(图 1C )。

图 1

图 1 沉默E2F1抑制U251细胞增殖

二、HDACIs抑制U251细胞E2F1表达

与对照组比较，TSA处理细胞8 h能抑制U251细胞E2F1表达(图 2A )。而且，与TSA一样，NaBu、VPA、SAHA和M344均能抑制E2F1表达(图 2B )。

图 2

图 2 HDACIss抑制U251细胞E2F1表达

三、HDACIs抑制U251细胞增殖

多组间比较差异有统计学意义(F=29.39，P=0.01)。与对照组比较，TSA处理细胞8 h不影响增殖率(P>0.05)，但处理12 h抑制细胞增殖(P＜0.05)，处理24 h抑制效应更明显(P＜0.05)，见表 1。

表 1

表 1 SA处理细胞不同时间对U251细胞增殖的影响(n=3,x±s) 处理物时间 DMSO TSA 0 h 8 h 12 h 24 h 增殖率 100±0 98±5 72±5 28±2 P0 h vs 8 h=0.2 P8 h vs 12 h=0.01 P12 h vs 24 h=0.007 注：DMSO为对照组；增殖率=TSA处理组细胞数/DMSO组细胞数×100%(特定时间点)

表 1 SA处理细胞不同时间对U251细胞增殖的影响(n=3,x±s)

HDACIs包括NaBu、VPA、SAHA、M344处理U251细胞24 h均能抑制细胞增殖，各组与DMSO相比，差异均有统计学意义(P均＜0.05)，见表 2。

表 2

表 2 DACIs处理U251细胞24 h对细胞增殖的影响(n=3,x±s) 处理物 DMSO TSA SAHA NaBu VPA M344 增殖率 100±0 32±2 41±5 58±5 65±7 44±8 P值a 0.001 0.003 0.009 0.01 0.002 注：aDMSO对照组与各个HDACIs处理组比较

表 2 DACIs处理U251细胞24 h对细胞增殖的影响(n=3,x±s)

我们的研究显示，沉默E2F1抑制神经胶质瘤细胞株U251；TSA抑制E2F1表达发生在抑制细胞 增殖之前；所使用的HDACIs均能抑制E2F1表达 和肿瘤细胞增殖。笔者查阅文献发现，这是首次报道HDACIs能靶向抑制E2F1表达及其介导的胶质瘤细胞增殖。

E2F1是第一个被鉴定的具有转录活性的E2F家族成员，其活性受上游CDKs/Rb等分子精确调控，在调节细胞周期由G1期进入S期中发挥主导作用^[8-9]。由于p16、Rb、p21等抑癌基因在高级别胶质瘤样本中发生高频缺失，E2F1对胶质瘤细胞增殖的作用在过去的研究中得到格外关注^[10-11]。多家实验室包括我们均观察到利用小分子干扰RNA或反义核苷酸片段抑制E2F1表达抑制了胶质瘤细胞增殖。而且，多个微小RNA(miRNA)包括miRNA-329、miRNA-106a、miRNA-136、miRNA-138等均通过抑制E2F1表达抑制胶质瘤细胞增殖^[12-15]。可见，在上游抑制信号缺失的情况下，E2F1的持续激活是造成胶质瘤细胞恶性增殖的关键原因之一，因而其是一个理想的分子靶点。

HDACIs的抗癌作用缘于其突出的促进肿瘤细胞凋亡或抑制细胞周期效应，而这些效应在正常细胞中的敏感性明显下降^[16]。有文献报道HDACIs通过上调E2F1进而上调Bim等BH3-only蛋白促发线粒体依赖的细胞凋亡^[17]。但在胶质瘤细胞株U251中，无论加大HDACIs浓度或是延长处理时间，我们都只检测到E2F1表达被抑制，而没有检测到E2F1被上调。可见，HDACIs抑制E2F1表达也是重要的抗癌机制之一。

总之，我们发现了HDACIs抑制E2F1表达进而抑制胶质瘤增殖的新机制。我们的研究一方面进一步支持了E2F1是治疗胶质瘤的理想靶点，另一方面提示HDACIs可能是的治疗胶质瘤的理想药物。未来我们的工作将进一步明确HDACIs调控E2F1表达的分子机制。