糖尿病视网膜病变（DR）是糖尿病最常见的并发症之一，也是工作年龄人群的首位致盲性眼病^[1-3]。2型糖尿病成年患者中，有20%～40%合并DR，8%有严重视力丧失^[4]。DR的发生发展源于视网膜微血管病变，主要病理改变包括视网膜炎症、视网膜微血管通透性增加和视网膜异常血管新生等。尽管诸多研究集中于DR，但由于发病机制复杂，目前仍未完全阐明。

6-磷酸果糖激酶-2/2,6双磷酸激酶又称诱导型6-磷酸果糖激酶-2，可通过激活6-磷酸果糖激酶-1从而促进糖酵解。有研究证实，在血管内皮细胞中的糖酵解速率明显高于其他细胞，如肝细胞、脂肪细胞、巨噬细胞等，能量代谢速率几乎与肿瘤细胞相当^[5]。而促进糖酵解的关键酶6-磷酸果糖激酶-2/2,6双磷酸激酶同工酶3(PFKFB3)在内皮细胞中高表达并通过体内外实验已证实PFKFB3参与血管新生，当抑制PFKFB3表达时，血管生成受到明显抑制^[5-8]。因此，PFKFB3及其下游信号通路可能是DR发生发展的重要调控途径。

一、PFKFB3概述

PFKFB3是一类调节细胞内2,6-双磷酸果糖水平的双功能酶，在调节糖脂代谢中起重要作用。PFKFB家族由4种同工酶组成，分别由PFKFB1-4基因编码。这4种同工酶均含有两个催化中心，具有使6-磷酸果糖磷酸化生成2,6-双磷酸果糖的激酶活性以及使2,6-双磷酸果糖去磷酸化生成6-磷酸果糖的磷酸酶活性，不同之处在于每种同工酶的激酶/磷酸酶活性比有差异。其中PFKFB3基因（位于人类10号染色体上）编码的3号同工酶较其他3个同工酶而言，具有最高的激酶/磷酸酶活性比（其激酶活性约为磷酸酶活性的700倍，而其他3个同工酶该比值接近1∶1），它几乎仅表现出促进2,6-双磷酸果糖生成的作用^[9-12]。此外，有研究发现虽然4种同工酶在组织细胞中存在共表达的情况，比如在原代人上皮细胞中4种同工酶的mRNA均有表达，在小鼠成纤维细胞中则检测到PFKFB2-4 mRNA的表达，但是4种同工酶对糖酵解的影响程度不尽相同，在敲除了PFKFB3基因的小鼠体内细胞中2,6-双磷酸果糖在细胞内的水平下降最为显著^[13]。这提示了细胞内2,6-双磷酸果糖的水平主要受PFKFB3的调控。

当PFKFB3基因受到低氧、炎症刺激因子、生长因子等因素刺激时其表达上调，它编码的产物也表现出更高的激酶活性，通过促进2,6-双磷酸果糖的生成，继而激活6-磷酸果糖激酶-1，起到提升糖酵解速率的作用^[14-19]。

基于PFKFB3主要通过调节糖酵解途径的速率而发挥作用。目前已知具有较高糖酵解速率的肿瘤细胞，其存在“Warburg效应”（由Warburg教授在1926年首次提出），即在氧气供应充足的情况下其糖酵解途径的速率也明显高于正常细胞。有研究则表明，在肿瘤组织中PFKFB3的表达量也显著高于正常组织^[16]。此外，肿瘤组织中PFKFB3表达水平上调与DNA合成的时相相关，在G1中后期和S期PFKFB3的表达量明显升高，且在S期达到峰值，当沉默PFKFB3基因可阻滞细胞进入S期从而抑制细胞增殖，同时抑制细胞凋亡^{[16, 20-22]}。当抑制PFKFB3基因表达时肿瘤组织的生长也明显减缓^[24-25]。以上表明PFKFB3通过促进糖酵解、加快细胞周期、抑制凋亡等多种途径参与细胞的增殖。

二、PFKFB3与DR 1、DR的微血管病理改变

DR是糖尿病最主要的微血管并发症之一，依据是否出现病理性血管增殖可将DR分为非增殖性视网膜病变(NPDR)和增殖性视网膜病变(PDR)两类。

视网膜毛细血管主要由血管内皮细胞和周细胞组成，两者结构功能的完整对维持视网膜毛细血管稳定性具有十分重要的作用^[26]。DR早期的病理改变为毛细血管周细胞减少、内皮细胞增生及基底膜增厚，这些因素导致毛细血管的完整性受到破坏等并使其管腔变得狭窄。而高血糖导致的血流动力学改变进一步使得毛细血管阻塞，最终导致毛细血管闭塞。闭塞的毛细血管失去灌注，进一步加剧了局部视网膜组织缺血缺氧，导致视网膜血管损伤，进一步发展则可出现黄斑水肿、新生血管形成和纤维化，即进展为PDR^[27-28]。

新生血管的形成与发展是PDR的关键，病理性增殖的新生血管可从视网膜延伸至玻璃体内。新生血管脆弱易出血，可导致玻璃体内出血，当机化条索形成时可引发牵拉性视网膜脱离，影响视力甚至致盲。而当眼球前段虹膜也出现新生血管时，其可向前房角生长并阻塞小梁网使房水流出受阻，眼内压升高，随后视神经因灌注受损出现萎缩。由此可见内皮细胞增殖以及血管新生可贯穿于整个DR发生发展的过程中，对其干预可成为治疗DR的重要途径。

2、PFKFB3促进血管内皮细胞的增殖和迁移

放射性示踪标记技术追踪糖进入血管内皮细胞进行代谢的不同途径，发现血管内皮细胞具有更高的糖酵解速率，甚至可与肿瘤细胞的糖酵解速率相当。它的糖酵解速率约为其他供能途径（如脂肪酸氧化、谷氨酰胺氧化等）速率的200倍。近85%的ATP通过糖酵解生成，而有氧呼吸的作用却不如前者显著（内皮细胞葡萄糖氧化、脂肪酸氧化或谷氨酰胺氧化的速率不及糖酵解速率的1%）。而且内皮细胞中线粒体体积不及细胞总体积的5%^[5]。有学者则提出，在内皮细胞中线粒体的作用更多的是发挥信号枢纽而非为细胞供能^[30]。基于内皮细胞对糖酵解途径的依赖，使得调节糖酵解途径的酶对内皮细胞的作用不容忽视。

PFK-1是糖酵解途径中重要的限速酶，它最强的变构激活剂即为PFKFB3，抑制PFKFB3基因表达可使糖酵解速率降低35%～40%^[30]。当视网膜病变研究中最常用的细胞模型——脐静脉内皮细胞（HUVEC）处于低氧状态（氧气浓度05%）或使用血管内皮生长因子（VEGF）干预后，可观察到PFKFB3的mRNA及蛋白表达水平均有明显上调^[7]。而予以3PO（抑制PFKFB3基因表达的小分子化合物）干预或使用腺病毒转染HUVEC抑制其PFKFB3基因表达后，处于静息期的HUVEC比例增大，且其增殖和迁移均受到抑制^[6-7]。然而，更进一步的研究发现，抑制PFKFB3基因表达所引起的上述改变却并非由于糖酵解途径受阻导致细胞供能不足所致。

当抑制HUVEC的PFKFB3基因表达后，通过测定其ATP、ADP及AMP浓度发现它的能量负荷（即在总的腺苷酸系统中所负荷的高能磷酸基数量：[ATP]+1/2[ADP]/[ATP]+[ADP]+[AMP]）以及ATP的浓度并未降低，没有出现内质网应激、氧化应激、自噬增强或引发细胞死亡。但同时，沉默PFKFB3基因后的HUVEC也没有观察到葡萄糖氧化、脂肪酸氧化或呼吸作用的增强以抵偿由于糖酵解途径受阻而带来的能量损失。而为了维持ATP的水平，沉默PFKFB3基因的HUVEC则是相应地减低了ATP的消耗，其高耗能过程均减弱（如蛋白质合成、内皮细胞增殖等）并且促进细胞进入静息态（G0期）^[5]。这表明当内皮细胞糖酵解途径受抑制后，细胞并未出现供能不足的情况，也未通过其他供能途径代偿性活跃来代替受阻的糖酵解途径产能，而是通过抑制细胞的高耗能过程，从而建立了一个新的能量代谢平衡来适应能量供应降低的境况。

以上均表明，糖酵解在内皮细胞中占有重要地位，而PFKFB3基因作为一个代谢基因通过调控糖酵解途径从而可显著影响内皮细胞能量代谢，进而影响其自身增殖以及细胞功能。前面我们提到，在DR发生的早期即NPDR时期，视网膜微血管的主要病理改变为周细胞丧失所引起的内皮细胞过度增殖，PFKFB3与此过程密不可分，抑制PFKFB3基因的表达可显著抑制内皮细胞增殖且促进其进入静息态，在早期则可延缓DR的发展。

3、PFKFB3促进血管新生

血管新生指在原有毛细血管基础上，经过内皮基膜降解，内皮细胞增殖、迁移、分化、出芽或内填方式形成新生血管的过程。而PFKFB3则可通过影响内皮细胞的增殖和功能从而调节血管新生。

小管形成实验为一种研究体外血管新生的模型，研究发现在该模型中沉默内皮细胞PFKFB3基因后其血管形成率较对照组降低了约40%～46%，而过表达PFKFB3基因后血管形成率则较对照组升高了约52%～60%^[7]。2013和2014年有研究先后发现，在另一种血管新生的体外模型——内皮细胞球中，过表达或沉默该模型中内皮细胞的PFKFB3基因抑或抑制PFKFB3基因的表达后，内皮细胞球的新生血管芽数量和长度均与PFKFB3基因表达量改变的趋势一致^[5-6]。而以上结果，在体内实验中同样得到了印证。在研究血管生成的典型模型——斑马鱼模型中，3PO可抑制斑马鱼胚胎体节间血管（ISV）的生成，且这些生成的ISV存在灌注障碍^[6]。而更细化到视网膜方面，在给予腹腔注射3PO或敲除PFKFB3基因的新生小鼠模型中，其视网膜的新生血管数、血管分支数、血管丛径向膨胀程度都明显减少，视网膜新生血管丛的面积较对照组小鼠小50%～55%^[5-7]。此外，在高氧诱导的视网膜病变小鼠模型中，当高氧引起小鼠视网膜微血管损伤导致视网膜灌注受损后，将小鼠放回正常氧浓度环境中饲养，其视网膜则会反应性地出现大量新生血管且部分为无功能血管，这一病理过程近似于糖尿病视网膜病变，而自小鼠回到正常氧浓度环境中时就给予腹腔注射3PO，5 d后将视网膜铺片染色可观察到新生血管明显少于对照组小鼠^[6]。这些实验证据均表明，PFKFB3可促进血管新生，而无论在生理或病理状态下抑制PFKFB3基因表达均可以抑制血管新生。

血管新生过程中内皮细胞可分化为不同的亚型：位于血管芽前端的端细胞伸出丝状伪足和板状伪足，它极少增殖而是发挥向导作用；柄细胞跟随于端细胞之后，主要通过增殖发挥延长血管芽的作用；一旦新生血管得到灌注后，内皮细胞即进入静息状态成为方阵细胞^[31-32]。近年来有研究发现，沉默PFKFB3基因后对血管新生的影响，则主要通过影响血管生成过程中端细胞的生物活性和功能以及它伪足的生成和迁移来调节血管新生^[5]。

因此，在血管新生层面，PFKFB3同样具有显著的作用。即在出现了新生血管的PDR时期，若抑制PFKFB3基因的表达，除了影响内皮细胞的能量代谢而抑制内皮细胞增殖外，它还通过影响内皮细胞的功能（伪足生成、亚型分化等）而抑制血管芽的形成从而抑制血管新生，这一作用有助于延缓PDR的进展。

三、结语

随着全球糖尿病人数的不断增长，DR患者的人群也在不断扩大，目前大多对DR发生发展过程中内皮细胞过度增殖和病理性血管新生的研究都集中在抑制VEGF的作用上，然而其成效却并不显著且已发现有诸多不良效应，因此我们需要转换视角，去寻求一种新的抗血管生成的策略。由于在血管内皮细胞从静息期转入活动期，进行血管发生作用的时候，糖酵解作用是血管内皮细胞的一大供能途径，因此通过影响糖酵解途径来调控血管生成即成为一条值得关注的途径。PFKFB3基因作为调控糖酵解途径的一个重要代谢基因，虽然迄今为止关于其在DR中的作用研究仍有限，但从目前已有的研究结果看来，通过调节PFKFB3改善内皮细胞功能及病理性的血管新生从而干预DR的病理进程可能成为一个有效的治疗策略。对PFKFB3与DR的关系进行更进一步深入的研究，将为DR发病机制的研究提供新的方向。