我国肝癌的病死率在所有恶性肿瘤中仅次于胃癌、肺癌，位列第三。肝癌的远期疗效不佳，转移率非常高，因而研究肝癌的发病、转移机制对改善其预后有着重要意义。肝癌的发生和转移不仅与其所在组织的结构、代谢和功能有关，还与肝癌细胞所处的微环境，即癌细胞、细胞因子、多种基质细胞、趋化因子等组成的微环境有关^[1]。肝星状细胞是肝癌微环境的重要间质细胞，活化的肝星状细胞能够分泌多种细胞因子影响肝癌细胞微环境，促进肝癌的发生和发展^[2]。本研究通过建立体外永生化人肝星状细胞株LX-2上清与人肝癌细胞株MHCC-LM3的共培养模型, 观察共培养后MHCC-LM3细胞的形态转变以及MHCC-LM3侵袭能力及其上皮间质转化(EMT)相关标记物的表达变化，初步探讨肝星状细胞对肝癌细胞株MHCC-LM3 EMT的影响。

人肝星状细胞LX-2、人肝癌细胞株MHCC-LM3购自上海中科院细胞研究所。高糖DMEM培养基、胰酶消化液购自美国Gibco公司，Transwell小室购自美国Coming公司，胎牛血清购自杭州四季清生物公司；Matrigel生物胶购自美国BD公司；鼠抗人E-钙黏蛋白(E-Cadherin)单克隆抗体、鼠抗人波形蛋白(Vimentin)单克隆抗体及内参磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)购自南京凯基公司。

肝癌细胞株MHCC-LM3在37 ℃、5%CO₂条件下，用10%胎牛血清的DMEM高糖培养基培养, 细胞长满单层后用胰蛋白酶消化传代。肝星状细胞LX-2以含10%胎牛血清的DMEM培养基培养至80%满度，换无血清的培养基继续培养48 h，以10 000×g离心10 min，收集上清，-80 ℃冻存待用。

收集对数期细胞，将MHCC-LM3细胞调至1×10⁸/L，以DMEM培养基接种于96孔板中，每孔200 μl, 培养至约80%满度, 换成无血清的DMEM培养基，继续培养18 h, 实验组加入上述制备的200 ml LX-2上清，分别继续培养12、24、48 h，对照组用无血清培养基分别继续培养12、24、48 h，到时间点后于倒置显微镜下观察细胞形态学变化。

将基底膜铺在Transwell膜上, 37 ℃包被聚合，加入含牛血清白蛋白的无血清培养基，置37 ℃ 30 min。在Transwell上室加入MHCC-LM3，实验组下室加入2 ml LX-2上清，对照组为下室加入的无血清培养液，分别培养12、24、48 h，到时间点后，取出小室，用棉签擦掉小室上室面的细胞及基质胶，于95%乙醇中固定15 min，3%结晶紫染色30 min。将小室放于倒置显微镜下，200倍放大倍数下随机观察细胞侵袭情况，每个样本随机取10个视野(放大倍数200倍)拍照，计数侵袭至小室下层的细胞，取平均值。每组重复3次。

收集各组细胞，加入600 μl RIPA细胞裂解液，置冰上30 min后，离心30 min，上清即为总的细胞蛋白溶解成分。上清加等量2倍十二烷基磺酸钠(SDS)上样缓冲液在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳，然后电转膜到醋酸纤维膜上，用50 g/L脱脂奶粉封闭，分别加入相应一抗(E-Cadherin、Vimentin抗体)，4℃孵育过夜，Tris-HCl缓冲液洗膜3次，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗(1:10 000)在37℃孵育2 h，常规洗膜3次，增强化学发光(ECL)荧光显色系统检测，X线片感光显影，AlphaImager 2200图像系统分析灰度值。每组重复3次。

应用SPSS 17.0统计软件进行结果分析。计量资料以x±s表示，组内比较用配对t检验，组间比较用成组设计t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

MHCC-LM3呈卵圆形、长椭圆形的上皮样细胞形态，其形态规则，相互间排列紧密，经与肝星状细胞LX-2上清共培养12、24、48 h后，其细胞形态与对照组相比，逐渐由圆形片团状生长变化为长梭形，细胞的移动不像对照组细胞整片或整块地移动，能单个活动，离开原来的位置，明显出现EMT的特征性形态学改变，见图 1。

图 1

图 1 肝星状细胞上清对肝癌细胞株MHCC-LM3形态的影响(×400) A：对照组；B：实验组培养12 h；B：实验组培养24 h；B：实验组培养48 h

肝星状细胞上清培养的肝癌细胞株MHCC-LM3在12、24、48 h的侵袭细胞数均多于对照组(12 h：68.67±3.61 vs. 38.68±5.56，t=13.008、P < 0.001；24 h：125.34±5.23 vs. 57.06±5.25，t=9.077、P < 0.001；48 h：276.38±5.53 vs. 108.69±3.55，t=11.067、P < 0.001)。实验组中，肝星状细胞上清培养24 h时的侵袭细胞数多于12 h时(t=8.162、P < 0.001)，48 h时的侵袭细胞数亦多于24 h时(t=10.187、P < 0.001)，见图 2。

图 2

图 2 肝星状细胞上清对肝癌细胞株MHCC-LM3侵袭性的影响(×200) A：对照组12 h；B：对照组24 h；C：对照组48 h；D：实验组12 h；E：实验组24 h；F：实验组48 h；G：定量分析结果；与对照组比较，*P < 0.01；与实验组前一时间点比较，#P < 0.01

肝癌细胞株MHCC-LM3经与肝星状细胞LX-2上清培养24、48 h后其上皮标记基因E-cadherin蛋白表达水平均低于对照组，分别为2.020±0.178 vs. 1.652±0.021(t=6.067，P < 0.001)、1.478±0.262 vs. 1.073±0.062 (t=5.377，P < 0.001)，而12 h时2组E-cadherin蛋白表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。肝癌细胞株MHCC-LM3经与肝星状细胞LX-2上清培养12、24、48 h后其上皮标记基因Vimentin蛋白表达均高于对照组，分别为1.172±0.182 vs. 1.397±0.152 (t=5.071，P < 0.001)、1.302±0.062 vs. 1.772±0.092 (t=6.827，P < 0.001)、1.688±0.123 vs. 2.166±0.072(t=5.067、P < 0.001)，见图 3。

图 3

图 3 肝星状细胞上清对肝癌细胞株MHCC-LM3 EMT相关上皮标记物的影响 A：蛋白免疫印迹结果；B、C：定量分析结果；与对照组比较，*P < 0.01；与实验组前一时间点比较，#P < 0.01

肿瘤微环境是恶性肿瘤生物学特性的研究热点，肿瘤细胞能表达多种细胞趋化因子受体，并在微环境中其他的基质细胞合成趋化因子的作用下，促使肿瘤生长并向他处转移。在肝癌组织中，肝星状细胞是重要的间质细胞。近年发现EMT在肝癌侵袭转移的过程中起着重要作用^[3]。EMT参与肿瘤的侵袭及转移，以上皮表型的缺失和间质表型的获得为主要特征^[4]。

活化的肝星状细胞发生了形态学和功能学的双重变化，表现为：①细胞体积变大，增殖活跃；②脂质减少或丢失；③α-平滑肌蛋白表达阳性；④不仅对细胞因子如血小板源生长因子、转化生长因子-β反应性增加，并自分泌大量细胞因子维持其自身活化状态；⑤同时分泌大量细胞外基质，尤其是Ⅰ、Ⅲ型胶原^[5-7]。肝癌的发展和转移伴随着肝星状细胞的活化，肝星状细胞的活化能否对肝癌的上皮间质转化起促进作用，目前相关报道较少。本研究中，将人肝星状细胞LX-2上清与人肝癌细胞MHCC-LM3共培养后，肝癌细胞由原来的圆形片团状生长变化为长梭形，并且表现出细胞间连接减弱、分离、组织间极性下降的倾向，表现出间质细胞形态特征。随后的Transwell侵袭试验结果显示，肝星状细胞的上清能够使得MHCC-LM3细胞更加具有侵袭性，并随着共培养时间的延长, MHCC-LM3细胞的侵袭能力也随之增强，符合MHCC-LM3经诱导EMT后侵袭性增强的特点，提示肝星状细胞可以促进肝癌细胞株MHCC-LM3的EMT，这可能与活化后的肝星状细胞能够分泌多种细胞因子影响肝癌细胞微环境有关。

判断EMT的发生，除细胞形态学发生变化之外，更为重要的指标是其相关标记蛋白表达的变化。上皮标记物E-cadherin是一种跨膜蛋白，在维持上皮结构整体性方面起重要作用，其丢失会使相邻细胞分离，并导致上皮细胞极性消失，使得相邻细胞之间连接变得疏松，E-cadherin表达降低或缺失是EMT重要的变化^[8]。Vimentin是间质细胞来源的骨架蛋白，在上皮细胞不表达或表达非常低下。这类蛋白增多会导致骨架蛋白构成变化，使上皮源性细胞具有成纤维细胞特征，易于迁移及黏附^[9]。因此E-cadherin表达降低，Vimentin间质蛋白表达增高被认为是EMT发生的标志。本研究采用蛋白免疫印迹法检测EMT相关标记物的表达变化。结果显示，肝星状细胞上清与肝癌细胞株MHCC-LM3共培养后，其E-cadherin蛋白表达水平下降、Vimentin蛋白表达水平升高，进一步证实肝星状细胞对肝癌细胞株MHCC-LM3的EMT起促进作用。

综上所述，肝星状细胞促进肝癌细胞的EMT，增强肝癌细胞的侵袭能力，而其作用机制将是我们下一步研究的重点方向。