骨关节炎的基本病变包括软骨破坏和骨赘形成。分子机制研究表明，某些微小RNA(miR)会影响软骨细胞的表型转变、细胞凋亡和基因表达^[1]。其中，miR-335-5p可通过2个正反馈环促进鼠间充质干细胞的软骨形成^[2]。另外，关节软骨的营养很大一部分来自于关节液的渗透。本研究通过检测miR-335-5p在骨关节炎患者膝关节液中的表达水平，分析其与骨赘形成之间的相关关系，探讨miR-335-5p在骨关节炎发病中所起的作用。

选取2014年10月至2015年6月在深圳市第四人民医院香蜜湖风湿病分院住院或门诊就诊的膝骨关节炎患者20例，其诊断均符合1986年美国风湿病学会膝骨关节炎分类标准。其中男6例、女14例，年龄(55.0±9.6)岁。另选择非骨关节炎患者20例(均由骨科医师提供，为髌骨骨折、半月板损伤等外伤患者)为对照，其中男6例、女性14例，年龄(51.8±9.9)岁。2组患者的性别构成、年龄比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。本研究经过广东医学院附属福田医院伦理委员会审核批准，所有参与者均知情同意并签署知情同意书。

包括Trizol试剂(美国Life Technologies公司)，Taqman miR逆转录试剂盒(美国ABI公司)；ABI 7300型荧光定量PCR仪(美国ABI公司)，淋巴细胞分离液(北京鼎国昌盛生物技术公司)。PCR引物由上海英维捷基公司合成。

以依地酸二钠抗凝管收集关节液，高速离心，分离上清液。采用Trizol法提取关节液中miR，微量分光光度计检测RNA浓度以及纯度。采用Taqman miR逆转录试剂盒，按说明将提取的总miR逆转录成模板DNA。按试剂盒说明书将关节液中miR样品1 μl加入反应体系中，逆转录的反应条件为：16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min。U6的逆转录反应条件为：37℃ 30 min，85℃ 5 min。取1 μl 逆转录产物，用Taqman通用PCR反应混合物和Taqman miR 试剂 进行实时定量PCR。反应条件为：95℃ 10 min 1个循环；95℃ 15 s，60℃ 1 min 40个循环，FAM 通道，60℃收集荧光。在ABI 7300型荧光定量PCR仪(美国ABI 公司)上进行实时荧光定量PCR，每个标本做3个复孔。以 SDS 2.0(PE Biosystem)软件分析其Ct值。计算各标本平均Ct值，以小分子 RNA U6作为内参，将miR-335-5p的 Ct 值减去U6的Ct值作为△Ct值。△Ct值越低，则miR-335-5p的表达水平越高。 实验中所使用的的引物序列见表 1。

表 1

表 1 miR-335-5p的PCR引物序列 基因 引物序列 miR-335-5p 正向 5'-GAGTTGACCACAGCACCTC-3' 反向 5'-GAGACAGTTCTCGTTATTGC-3' U6 正向 5'-TGGGGTTATACATTGTGAGAGGA-3' 反向 5'-GTGTGCTACGGAGTTCAGAGGTT-3'

表 1 miR-335-5p的PCR引物序列

采用SPSS 18.0 软件包进行数据统计分析。计量资料以x±s表示，组间比较用独立样本t检验；变量间相关性采用Spearman秩相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

miR-335-5p在骨关节炎患者关节液的△Ct值为9.78±2.50，非骨关节炎患者关节液的△Ct值为8.23±2.13，miR-335-5p在骨关节炎患者关节液的表达水平低于非骨关节炎患者(t=2.844，P=0.048)。

miR-335-5p在骨关节炎患者关节液中的相对表达量与Kellgren-Lawrence的X线分级之间相关性分析显示，miR-335-5p的△Ct值与Kellgren-Lawrence 的X 线分级无关(r_s=-0.351，P=0.062)，见表 2。

表 2

表 2 骨关节炎患者的Kellgren-Lawrence X线分级与miR-335-5p相对表达量 项目 Kellgren-Lawrence X线分级 0级 1级 2级 3级 例数 5 12 2 1 miR-335-5p相对表达量(△Ct值) 10.15±5.90 9.38±2.59 5.98±3.37 6.88

表 2 骨关节炎患者的Kellgren-Lawrence X线分级与miR-335-5p相对表达量

在骨关节炎的相关研究中，科研人员已经发现越来越多的miR与关节炎的发生有着千丝万缕的联系，miR介导的基因表达的转录后抑制在成骨分化的调控中起重要作用。通过大量关节炎临床样本发现，这些内源性miR的表达水平发生了明显的改变，并且与关节炎的发生、发展有着密切的联系^[3]。Iliopoulos等证实与正常软骨相比，有16个miR在骨关节炎软骨中表达异常。在这些miR中，miR-22表达上调，减少了蛋白聚糖的表达，增加了软骨细胞中IL-1b和基质金属蛋白酶-13水平，而miR-140表达下调，可出现与年龄相关的骨关节炎样改变^[4]。黄浩等^[5]认为miR可通过介导机制、染色质修饰及DNA甲基化的改变3个方面参与骨关节炎的发生、发展。

miR-335在人类定位于7q32.2，可调节人干细胞的增殖、迁移和分化^[6]。DKK1是一种分泌蛋白，通过与Wnt受体复合体LRP5/6结合抑制Wnt信号通路，导致骨代谢异常^[8]。研究认为，miR-335在骨动态平衡中起到重要的调节作用，miR-335-5p可直接靶向DKK1 3'-非翻译区，通过下调DKK1，调节成骨分化^[7]。对骨关节炎的研究发现，所有参与调节成骨细胞分化的miRNA中，靶向DKK1的miR仅有miR-29a和miR-335-5p^[9]。

本研究显示，miR-335-5p在骨关节炎患者关节液中的相对表达水平低于非骨关节炎患者，这种表达降低，可能影响到其靶基因DKK1和SFRP1的表达，进而作用于Wnt信号通路导致骨代谢异常。研究发现，组织损伤或促炎信号可能引起miR-335下调，继而激活骨髓间充质干细胞 (MSC) 的增生、迁移和分化能力^[10]。Tornero-Esteban等^[11]研究也发现，miR-335在骨关节炎患者骨髓的间充质干细胞中表达较对照组低，且认为这种下调是骨关节炎-MSC固有的表现，通过Wnt信号通路，影响了骨关节炎的骨生成和矿化。miR是一类在进化上高度保守的非编码小分子单链RNA。在正常状态下，miR的表达具有严格的组织及时序特异性，当miR异常表达时则可能导致疾病的发生。因此，骨关节炎患者关节液中miR-335-5p表达下调，提示miR-335-5p可能与骨关节炎的发病机制相关。

Kellgren-Lawrence的X线分级是衡量骨关节炎患者关节损伤和骨赘增生程度的一个重要指标，可划分为0~4级，级别越高，关节间隙越狭窄，骨赘增生越严重。本研究显示，骨关节炎患者miR-335-5p的相对表达量与Kellgren-Lawrence的X线分级之间无关。这种相关性的缺乏，提示miR-335-5p虽与骨关节炎相关，但与骨赘形成之间并无直接的关系，表明miR-335-5p可能不会促进骨赘形成，但对其是否会抑制骨赘形成，需要进一步研究。

综上所述，miR-335-5p在骨关节炎患者关节液中表达下调，提示miR-335-5p在骨关节炎发病及病情进展中可能起到一定的作用，而这种作用是否通过调控靶基因DKK1激活Wnt/β-catenin信号通路参与骨关节炎发病，是否能成为骨关节炎诊断与治疗的新靶点尚需要进一步研究。