溃疡性结肠炎(UC) 是炎症性肠病(IBD) 的一种类型，它以累及结直肠黏膜层、黏膜下层的弥漫性炎症为特征。至今，UC的病因与发病机制尚不明确，大量研究表明其发病与遗传易感性、肠道微生物及肠道黏膜的免疫反应有关^[1]。血管活性肠肽(VIP) 是一种由28个氨基酸组成的神经多肽，它在体内分布广泛，如心脏、肺脏、消化道等，参与多种生理功能。在消化道，VIP可通过作用于其相应的受体VPAC1调节胃酸及胃肠激素的分泌、血管舒张、调节肠道炎症反应等，特别在炎症性肠病中发挥着抗炎作用^[2-3]。本文通过收集临床UC样本以及建立DSS诱导UC小鼠模型，试图探讨VIP对结肠黏膜损伤的作用。

无特定病原体(SPF) C57/BL6小鼠30只，雌雄各半，8周龄，体质量20~25 g，购自中山大学北校区动物实验中心。

葡聚糖硫酸钠(DSS，MP Biomedicals)、TUNEL试剂盒(Roche)、Trizol (Sigma)、VIP (Sigma)、VPAC1抗体(Sigma)、p-AKT和AKT抗体(Cell Signaling Technology)、PCNA抗体(Santa Cruz) 及β-actin抗体(Santa Cruz)、DAB显色液(DAKO)。

将小鼠随机分为3组，每组10只。正常对照组小鼠自由饮用蒸馏水7 d，急性UC模型小鼠自由饮用含3%DSS的蒸馏水7 d，VIP处理组小鼠在饮用3%DSS的第1、3、5日给予VIP腹腔注射(1 nmol/只)^[4]。在第7日处死小鼠。

每日观察及记录小鼠的体重变化、粪便性状及粪便隐血情况进行疾病活动指数评分：体质量正常为0分，体质量减轻小于等于5%为1分，减轻大于5%~10%为2分，减轻大于10%~20%为3分，减轻大于20%为4分；粪便成形为0分，糊状/半成形为1分，稀便为4分；粪便潜血阴性为0分，粪便潜血阳性为2分，肉眼血便为4分。三者总分相加即为每只小鼠的疾病活动指数^[5]。

在肠镜下取急性期UC患者及正常对照者(各10例) 的结肠黏膜数块。对于小鼠，在造模第7天颈椎脱臼处死，剖腹并迅速取出结肠，沿肠系膜剪开并用预冷的生理盐水漂洗干净。结肠组织部分放入10%福尔马林中固定制成石蜡标本，部分于冰上刮取肠黏膜后保存于-80℃，待提取RNA和蛋白质。

石蜡切片经过脱石蜡和阶梯水化后，置于3%H₂O₂中室温10 min以阻断内源性过氧化物酶；将切片放入pH 6.0的柠檬酸缓冲液中进行抗原高压热修复2 min；待温度降至室温后开锅取出切片，室温下血清封闭15 min；分别滴加抗-VPAC1(1：150)、抗-PCNA (1：300)、抗-p-AKT (1：200) 抗体，4℃孵育过夜；PBST冲洗5 min，滴加二抗37℃孵育2 h；PBST冲洗5 min，DAB显色1-5 min，苏木素染核后封片。在显微镜下观察。根据染色综合评分判断其表达情况的高低^[6]。

参照Roche公司的TUNEL产品说明书进行检测操作，DAB显色后细胞核呈棕褐色为阳性。每张切片随机选取20个视野，计算阳性细胞数和上皮细胞总数，凋亡指数=阳性细胞数/上皮细胞总数×100%。

按照Trizol试剂说明书提取结肠黏膜总RNA后，按照TOYOBO逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录合成cDNA。应用SYBR GreenⅠ法对目的基因VIP、VPAC1及内参基因β-actin进行Real-time PCR扩增。

按照总蛋白提取裂解液操作说明书对结肠黏膜组织总蛋白进行提取与定量，取样本蛋白进行电泳；电泳印记转至NC膜上；牛奶封闭2 h；分别滴加抗-VPAC1(1：1 500)、抗-PCNA (1：3 000)、抗-caspase-3(1：2 000)、抗-p-AKT (1：2 000)、抗-AKT (1：2 000)、抗-β-actin (1：3 000) 抗体，4℃摇床孵育过夜；TBST洗涤10 min，滴加相应的二抗室温摇床孵育2 h；TBST洗涤10 min，暗房曝光；印迹条带扫描后应用Image J图像分析软件进行灰度分析。

应用SPSS 20.0软件进行统计学分析。计量资料均以x±s表示，两组间比较采用两独立样本t检验，多组间比较应用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

提取UC患者的结肠黏膜的RNA后行Real-time PCR检测和分析，结果显示VIP、VPAC1两者的mRNA水平(分别为0.34±0.15及0.44±0.09) 均较正常对照组(分别为1.00±0.18及0.73±0.17) 下调(t值分别为6.300及3.371，P均 < 0.01，见图 1A)。人结肠黏膜VPAC1免疫组织化学染色显示，阳性信号主要表达在黏膜上皮细胞，UC组阳性信号明显少于正常对照组(见图 1B)。同样地，对3%DSS诱导的UC小鼠的结肠黏膜进行mRNA分析，结果VIP、VPAC1 mRNA水平亦较正常对照组降低[分别为(0.45±0.14 vs. 1.00±0.17，t=5.584)，(0.22±0.13 vs. 0.65±0.2，t=4.031)，P均 < 0.01，见图 1C]。对UC小鼠结肠黏膜行VPAC1免疫组织化学染色，其结果与UC患者样本相仿(见图 1D)。

图 1

图 1 人和小鼠结肠黏膜VIP和VPAC1的mRNA与蛋白水平 A：(人) 正常对照与UC结肠黏膜VIP与VPAC1 mRNA的相对水平；B：(人) 正常对照与UC结肠黏膜VPAC1免疫组织化学染色(×200)；C：(小鼠) 正常对照组与3%DSS 7天组结肠黏膜VIP与VPAC1 mRNA的相对水平；D：(小鼠) 正常对照组与3%DSS 7天组结肠黏膜VPAC1免疫组织化学染色(×200)；与正常对照组比较，*P < 0.01

小鼠饮用3%DSS 3 d时，开始出现体毛凌乱、体质量轻微减轻。第5日时除体重下降外，大便呈糊状，隐血阳性。到第7日，小鼠体质量明显下降，有肉眼血便。在第1、3、5日分别给予VIP腹腔注射后，发现小鼠的疾病活动指数从第3日起至第7日均明显低于3%DSS 7 d组小鼠，第7日未见肉眼血便(见图 2，表 1)。

图 2

图 2 小鼠UC疾病活动指数图 与3%DSS 7 d组比较，*P < 0.001

表 1

表 1 小鼠UC疾病活动指数分析(n=10, x±s) 组别 第1日 第2日 第3日 第4日 第5日 第6日 第7日 3%DSS 7 d 0 0 1.0±0.6 3.0±0.7 5.0±0.8 7.5±1.1 10.0±2.2 3%DSS 7 d+VIP 0 0 0 1.0±0.4 3.0±0.7 5.0±0.9 6.5±1.1 t值 - - 5.06 7.66 5.57 6.98 4.43 P值 - - ﹤0.01 ﹤0.01 ﹤0.01 ﹤0.01 ﹤0.01

表 1 小鼠UC疾病活动指数分析(n=10, x±s)

小鼠饮用3%DSS 7 d后，TUNEL染色显示结肠黏膜凋亡信号较正常对照组增多，信号主要集中在上皮细胞，而给予VIP腹腔注射后，小鼠结肠上皮细胞的凋亡信号明显减少(见图 3A-C)。提取结肠黏膜蛋白质做电泳免疫印迹检测分析可得，给予VIP后凋亡相关蛋白caspase-3蛋白表达量明显下调，其变化趋势与TUNEL染色结果一致(见图 4A、B，表 2)。免疫组织化学染色显示，饮用3%DSS 7天后，结肠黏膜PCNA、VPAC1信号较正常对照组减少，而给予VIP后阳性信号均比单纯3%DSS处理组明显增多(见图 3D-I)。同样的，PCNA、VPAC1蛋白质印迹趋势与免疫组织化学结果一致(见图 4A、C、D，表 2)。

图 3

图 3 小鼠结肠黏膜TUNEL染色相关蛋白质免疫组化染色(×200) A、B、C：正常对照组、3%DSS 7 d、3%DSS 7 d + VIP三组小鼠结肠黏膜TUNEL染色情况；D、E、F：三组小鼠结肠黏膜PCNA免疫组织化学染色情况；G、H、I：三组小鼠结肠黏膜VPAC1免疫组织化学染色情况

图 4

图 4 小鼠结肠黏膜相关蛋白质表达情况检测 A：正常对照组、3%DSS 7 d、3%DSS 7 d+VIP三组小鼠结肠黏膜Caspase-3、PCNA、VPAC1蛋白免疫印迹电泳图；B：Caspase-3灰度比值分析；C：PCNA灰度比值分析；D：VPAC1灰度比值分析；与正常对照组比较，*P < 0.01；与3%DSS 7 d组比较，#P < 0.05

表 2

表 2 相关蛋白质电泳免疫印迹条带的灰度比值分析(n=10, x±s) 组别 caspase-3/β-actin PCNA/β-actin VPAC1/β-actin p-AKT/AKT A组 0.11±0.05 0.74±0.17 0.61±0.13 0.80±0.16 B组 0.72±0.13 0.15±0.05 0.18±0.05 0.23±0.04 C组 0.33±0.06 0.43±0.09 0.40±0.10 0.47±0.09 F值 36.60 20.23 13.55 19.51 P值 ﹤0.01 ﹤0.01 ﹤0.01 ﹤0.01 注：A组为正常对照组；B组为3% DSS 7 d; C组为3% DSS 7 d +VIP; 与A组比较，B组caspase-3/β-actin LSD-t值=8.45，P < 0.01；B组PCNA/β-actin LSD-t值=6.36，P < 0.01; B组VPAC1/β-actin LSD-t值=5.21，P < 0.01; B组p-AKT/AKT LSD-t值=6.22，P < 0.01；C组caspase-3/β-actin LSD-t值=3.05，P < 0.05；C组PCNA/β-actin LSD-t值=3.34，P < 0.05; C组VPAC1/β-actin LSD-t值=2.54，P < 0.05；C组p-AKT/AKT LSD-t值=3.60，P < 0.05；与C组比较，B组caspase-3/β-actin LSD-t值=5.40，P < 0.01；B组PCNA/β-actin LSD-t值=3.02，P < 0.05; B组VPAC1/β-actin LSD-t值=2.66，P < 0.05; B组p-AKT/AKT LSD-t值=2.62，P < 0.05

表 2 相关蛋白质电泳免疫印迹条带的灰度比值分析(n=10, x±s)

对小鼠UC结肠黏膜行p-AKT免疫组织化学染色，显示信号主要位于上皮细胞，正常对照组p-AKT的表达量较多，予3%DSS 7 d后信号明显减少，而在小鼠饮用3%DSS期间予VIP腹腔注射后，可明显改善p-AKT信号减少情况(见图 5A)。同时行蛋白免疫印迹检测和灰度分析，结果显示p-AKT/AKT比值的变化趋势与免疫组织化学结果相一致(见图 5B、C，表 2)。

图 5

图 5 小鼠结肠黏膜p-AKT/AKT蛋白表达情况 A：正常对照组、3%DSS 7 d、3%DSS 7 d+ VIP三组小鼠结肠黏膜p-AKT免疫组织化学染色情况(×200)；B：3组小鼠结肠黏膜p-AKT/AKT蛋白免疫印迹电泳图；C：p-AKT/AKT灰度比值与正常对照组比较，*P < 0.05；与3%DSS 7 d组比较，#P < 0.05

UC是一类肠道慢性非特异性炎症疾病，其发病机制尚未明，目前主要认为与遗传、肠道微生物及肠道免疫反应有关。相关研究报道，胃肠道神经肽类激素参与了UC的发生发展^[7]。VIP是一个由28个氨基酸组成的神经多肽，在胃肠道主要分布在黏膜固有层和肌层神经纤维，可作为神经递质、免疫调节剂及炎症介质参与多种肠道生理及病理过程。既往已有较多研究证实UC患者结肠黏膜VIP的表达量是下降的^[8-9]。本实验对人以及小鼠结肠黏膜的VIP，及VIP相应的受体VPAC1，分别进行mRNA和蛋白质水平的检测和分析，结果发现两者水平在UC样本均较正常对照组明显降低，这与多数已报道的研究结果相似。基于VIP和VPAC1的水平在急性UC期是下调的，我们猜想VIP是否在肠道黏膜作为炎症介质起拮抗炎症的作用？而该作用是否在UC急性炎症期被抑制了？故本实验在小鼠饮用3%DSS造UC模型的过程中予以VIP腹腔注射处理，探讨VIP在溃疡性结肠炎中的作用。结果发现VIP处理后结肠黏膜VPAC1表达量有所上调，与单纯3%DSS处理相比，VIP处理组小鼠结肠黏膜上皮细胞凋亡情况明显减少，同时上皮细胞的增殖信号明显增多。说明VIP在急性UC发生过程中可能通过作用于上皮细胞的VPAC1受体，激活下游的信号通路，发挥着抑制上皮细胞凋亡，促进上皮细胞增殖的作用。

大量研究表明，组织在免疫损伤、炎症反应等多个环节，都有赖于各种细胞因子的调控。其中，AKT作为目前最热门的调节细胞存活和凋亡的激酶通路之一，已有大量文献报道其在溃疡性结肠炎过程中发挥着重要的作用，主要参与了细胞因子的调控和释放，抑制炎症反应的放大^[10-12]。在本研究中，小鼠饮用3%DSS 7 d后，结肠黏膜p-AKT蛋白表达量降低，而予以VIP处理后，p-AKT表达量明显增加，说明VIP可激活AKT信号通路。给予VIP刺激后，p-AKT表达上调，这与上皮细胞凋亡信号变化趋势是相反的，而与上皮细胞增殖变化趋势是一致的。这提示在UC肠道炎症反应中，VIP很有可能作用于结肠黏膜VPAC1受体后，激活AKT信号通路，通过调节相关基因的转录，从而抑制肠上皮细胞的凋亡，抑制肠道炎症的发生与发展。

综上所述，本实验通过对VIP在小鼠UC模型中作用的分析，阐明了VIP通过VPAC1/AKT信号通路在UC发生过程中抑制肠道炎症反应、抑制结肠黏膜上皮细胞凋亡、促进上皮细胞增殖的作用，为以后将VIP用于临床治疗UC提供了可靠的科学基础。