诱导多能干细胞 (iPSC) 是一类由体细胞重编程获得的具多向分化特性的干细胞。由于相比其他干细胞iPSC具有更易获得、可个体化、无伦理学争议等优点，故其在细胞替代治疗中展现出了独有的优越性^[1]。2010年，Nizzardo等^[2]用音猥因子和视黄酸诱导首次证实iPSC分化为运动神经元 (MN) 的可行性，而后许多课题组亦用类似方法获得成功。

运动神经元病 (MND) 是一种慢性进行性运动神经元变性疾病。iPSC来源的MN所提供的细胞替代疗法在该病有广泛应用前景^[3]。近年来的研究表明，在iPSC诱导分化为MN的过程中，除了音猥因子和视黄酸的作用，也涉及到其他许多信号分子，糖原合酶激酶-3(GSK3) 即为其中之一^[4]。GSK3是一类生物界高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，有抑制神经元增殖、促进细胞分化和凋亡的作用，参与帕金森病、阿尔茨海默病等神经变性疾病的发生发展^[5-7]。在前期研究中，我们已成功在体外将iPSC分化为表达MN标志物CHAT的细胞，但免疫荧光计数阳性率仅为30%^[8]。Reinhardt等^[9]在MN分化早期加入GSK3抑制剂使得分化效率接近50%。为了进一步提高分化效率并探究GSK3对分化的影响，我们探讨了GSK3抑制剂CHIR99021对iPSC向MN分化的影响及剂量效应。

实验细胞：实验所用人iPSC由中国科学院广州生物医药与健康研究院中国干细胞库南方库提供。试剂和培养基：mTeSR培养基购自STEMCELL Technologies公司，DMEM/F12、Neurobasal Medium、N2, B27、Glutamax、Antibiotic-Antimycotic、dispase、EDTA购自Invitrogen公司。抗坏血酸、CHIR99021(CHIR)、DMH1、SB341542(SB)、视黄酸、Purmorphamine (Pur) 购自Sigma公司。Compound E (Cpd E) 购自Calbiochem公司。脑源神经生长因子 (BDNF)、胶质源神经生长因子 (GDNF)、胰岛素样生长因子 (IGF) 购自Peprotech公司。Matrigel购自Corning公司。抗体：OCT4(1:200, abcam), Nanog (1:250, abcam), SSEA4(1:250, abcam), SOX1(1:300, Boster), Nestin (1:300, abcam), Olig2(1:500, millipore), ChAT (1:100, millipore), Map2(1:500, abcam), FITC标记的荧光二抗 (Invitrogen)，核染料DAPI (碧云天)。其他：磷酸盐缓冲液 (PBS)、多聚甲醛、驴血清、Triton-X100均购自威佳公司；培养板 (皿)、离心管均购自BD公司。采用Olympus荧光显微镜及Nikon T1-SM显微镜。

将iPSC接种至Matrigel提前包被的培养板 (皿)，用mTeSR培养基培养，每日换液。当细胞融合度达到70%~80%时用EDTA进行传代。在诱导分化前，鉴定人iPSC的干性，保证90%以上的细胞未分化。

体内MN发生发育涉及神经化 (neuralization)、尾端化 (caudalization) 和腹侧化 (ventralization)^[10]。我们采用模拟体内发育过程的分化方案，包括早、中、晚3个阶段并对各阶段细胞进行细胞计数、免疫荧光染色，观察细胞标志物表达情况。

按比例1:6将iPSC接种至Matrigel包被的6孔板，加入mTeSR培养基培养1 d，次日 (Day1) 换为神经分化培养基 (DMEM/F12和Neurobasal Medium按1:1混合, 再加入0.5×N2、0.5×B27、0.1 mmol/L ascorbic acid、1×Glutamax、1×Antibiotic-Antimycotic)。在此阶段加入利于iPSC向外胚层分化的Smad抑制剂SB和DMH1。同时为了研究GSK3对iPSC分化的影响，加入不同浓度的GSK3抑制剂CHIR, 按不同浓度分1、2、3、4 μmol/L (μM)4个实验组，以不加该抑制剂的0 μmol/L组作为对照组。培养6 d，隔日换液。

用1 mg/ml的dispase消化分化早期的细胞，按1:3的比例接种至新的培养板，继续用上述神经分化培养基培养，同时撤去Smad抑制剂和GSK3抑制剂，加入音猥因子通路激活剂Pur (0.5 μmol/L) 和RA (0.1 μmol/L)。在此条件下继续培养6 d，隔日换液。

用1 mg/ml的dispase消化分化中期的细胞，按1:1.5~1:2的比例接种至新的Matrigel包被的培养皿。加入神经分化培养基，此阶段将RA增至0.5 μmol/L，Pur减至0.1 μmol/L，隔日换液。培养的第6日在原来的基础上加入0.1 μmol/L Cpd E，继续培养6~7 d (Day25)，隔日换液。

用4%的多聚甲醛固定分化的细胞10 min，吸多聚甲醛后用PBS清洗3遍。加入封闭破膜液 (10%驴血清和0.22%Triton-X 100)，室温静置1 h。吸去封闭破膜液，加入一抗，4℃过夜。次日，吸去一抗，用PBS清洗3遍，加入相应荧光二抗。室温避光孵育1 h，再用PBS清洗3遍，最后加入DAPI和封片剂。用显微镜拍照留存。

用Image J软件进行细胞计数。阳性细胞比例用Graph Prism作柱形图以x±s的形式表述，独立实验重复3次。多组比较采用方差分析，再用LSD-t检验进行两两比较。P < 0.05为差异有统计学意义。

光镜下，iPSC细胞呈集落样生长，细胞排列紧密，克隆边界清楚。免疫荧光结果显示，细胞均表达干细胞标志物Oct4、Nanog、SSEA-4(图 1)。

图 1

图 1 iPSC干性鉴定 (×200) A：光镜下见iPSC细胞大小均匀一致，呈群落生长，细胞排列紧密；B~D：免疫荧光染色可见表达Oct4、Nanog、SSEA-4(Oct4、Nanog、SSEA-4染色为红色，核为蓝色)

对照组的单个细胞体积较大。实验组加入CHIR浓度越高，细胞聚集越紧密，浓度达到2 μmol/L时可见明显细胞群落形成，且越向中央细胞排列越紧密，细胞分布具有一定极性 (图 2)。以6孔板1个孔为单位行细胞计数 (单位10⁶个/孔)，结果示CHIR浓度越高细胞数量越多，0、1 μmol/L组细胞数 (分别为0.560×10⁶±0.053×10⁶, 0.630×10⁶±0.070×10⁶) 少于2~4 μmol/L组 (分别为0.946×10⁶±0.081×10⁶，1.053×10⁶±0.065×10⁶，1.130×10⁶±0.096×10⁶)，组间比较差异有统计学意义 (F=35.070、P＜0.001)，两两比较显示0 μmol/L组与2、3、4 μmol/L组比较P均＜0.001(LSD-t分别为6.343、8.093、9.351)；1 μmol/L组与2、3、4 μmol/L组比较P均＜0.001(LSD-t分别为5.195、6.945、8.203)；0 μmol/L组与1 μmol/L组比较差异无统计学意义 (LSD-t=1.148，P=0.278)(图 2A)。

图 2

图 2 CHIR对iPSC分化为NSC的影响 A：分化早期各组细胞密度；B：光镜及标志物鉴定；C：各组SOX1阳性率 (SOX1和Nestin免疫荧光染色为红色，核为蓝色，×100)

免疫荧光结果示，对照组和各实验组的细胞均表达NSC标志物SOX1、Nestin (图 2B)。说明各组iPSC均已分化为NSC，各组SOX1的平均阳性率比较差异有统计学意义 (F=5.312，P=0.012)。其中4 μmol/L组平均阳性率为86.080%，低于其他各组，两两比较显示4 μmol/L组的SOX1阳性率与0、1、2、3 μmol/L组比较差异均有统计学意义 (LSD-t分别为4.457、2.576、3.247、2.703，P分别为0.001、0.026、0.008、0.021)。其余0~3 μmol/L组阳性率90.622%~94.087%，相互间比较差异无统计学意义 (图 2C)。

分化中期，培养基中撤去了GSK3抑制剂CHIR，应用Pur和RA促进NSC向MN定向分化。光镜显示，0~2 μmol/L组的单个细胞体积较大，细胞数量少。3 μmol/L组细胞聚集形成玫瑰花结样结构 (rosette，该结构被认为是体外分化过程中形成的类似于体内神经发育过程中形成的神经管结构，故rosette的形成对神经进一步分化尤为重要)(图 3)。细胞计数结果示，细胞数量0.2×10⁶~0.5×10⁶，早期CHIR浓度越高组细胞数量越多，0~2 μmol/L组细胞数 (分别为0.243×10⁶±0.064×10⁶, 0.233×10⁶±0.047×10⁶, 0.287×10⁶±0.047×10⁶) 均少于3~4 μmol/L组 (0.457×10⁶±0.042×10⁶, 0.483×10⁶±0.055×10⁶)，组间比较差异有统计学意义 (F=16.193，P＜0.001)，进一步两两比较示0和1 μmol/L组与3、4 μmol/L组相比P均＜0.001(LSD-t分别为5.053、5.685、5.290、5.922)，2 μmol/L组与3、4 μmol/L组相比P分别为0.002、0.001(LSD-t分别为4.027、4.659, 图 3A)。

图 3

图 3 CHIR对iPSC向MNP分化的影响 A：分化早期各组细胞密度；B：光镜及标志物鉴定，3~4 μmol/L组细胞聚集成rosette (白箭头)，分布紧密；C：各组Olig2阳性率 (Olig2免疫荧光染色为红色，核为蓝色，×100)

免疫荧光结果显示各组均有细胞表达MNP标志物Olig2(图 3B)，但相互间阳性率的差异大，组间比较有统计学意义 (F=49.072，P＜0.001)。其中3 μmol/L组Olig2的阳性率最高 (67.660%)，3 μmol/L组与0、1、2、4 μmol/L组比较差异均有统计学意义 (LSD-t分别为12.845、7.934、3.931、3.137，P分别为＜0.001、＜0.001、0.003、0.011)。从对照组至3 μmol/L浓度组，Olig2阳性率逐渐增大，但4 μmol/L组阳性率反而下降。2 μmol/L和4 μmol/L组间阳性率比较差异无统计学意义 (LSD-t=0.794，P=0.446) (图 3C)。

分化晚期，培养基中加入低浓度Pur和高浓度RA继续诱导分化，培养至Day25，0~1 μmol/L组因细胞数量太少几乎无残存贴壁细胞，而2 μmol/L及以上浓度组则有较多细胞伸出长轴突 (图 4)。免疫荧光结果示2~4 μmol/L组细胞胞体和轴突胆碱乙酰转移酶 (ChAT) 染色阳性，标志着此3组细胞分化为成熟MN。

图 4

图 4 CHIR对iPSC向成熟MN分化的影响 A~C:光镜下见2~4 μmol/L组细胞胞体小, 伸出长突起 (黑箭头); D~F:免疫荧光示2~4 μmol/L组细胞的胞浆和轴突均表达成熟MN标志物ChAT, 白箭头为ChAT免疫荧光染色阳性的轴突 (ChAT免疫荧光染色为红色, 核为蓝色, ×200)

到目前为止，尚无有效方法治疗MND，随着疾病发展，患者会表现为肢体无力、肌束震颤，最终因呼吸肌无力死于窒息。iPSC被认为是细胞替代治疗各类神经退行性病变的理想细胞来源^[3]。现有的iPSC分化为MN的方案多为音猥因子和视黄酸信号通路激活剂联合诱导，这种方案分化效率约30~50%，故亟需更高效率的分化方案^[11-12]。

GSK3是广泛存在于身体各个部位且参与各种细胞生长代谢活动的激酶，在神经的发生、分化、轴突伸长中均起重要作用^[13]。多项研究表明抑制GSK3可以促进早期神经化的细胞增殖，但同时也抑制细胞进一步分化为成熟神经元，使细胞更倾向于自我更新而非分化^[14]。另外，许多研究也发现GSK3抑制剂对MND及其他神经系统疾病有保护神经、稳定神经元、抑制凋亡的作用^[15]。

基于前期研究，我们课题组试图探讨GSK3抑制剂在iPSC向MN分化中的作用。结果显示，在分化早期，iPSC分化为NSC，GSK3抑制剂的浓度越高，细胞密度越大。在分化效率方面，0~3 μmol/L组的NSC表达SOX1无差异，但高浓度 (4 μmol/L) 组SOX1的表达较其他组低。提示抑制GSK3可使细胞增殖更加旺盛，一定浓度的抑制剂 (≤3 μmol/L) 不会影响分化，但高浓度GSK3抑制剂则不利于分化，这与既往的研究结果一致^[8]。在接下来的分化过程中，分化培养基中撤去了GSK3抑制剂，加入音猥因子和视黄酸激活剂联合诱导细胞向MN分化。在细胞增殖方面，高浓度GSK3抑制剂组细胞密度高，细胞可以聚集成类神经管的rosette结构。在细胞分化方面，0~3 μmol/L组随着浓度的增高，MNP标志物Olig2的表达增高，提示在诱导分化MN早期加入一定剂量的GSK3抑制剂并不会对后期的定向分化产生影响，反而能起神经保护、稳定神经元的作用，为后期定向分化打下基础^[16]。但高浓度组 (4 μmol/L) Olig2的表达量反而下降，提示高浓度GSK3抑制剂不利于分化。最终2~4 μmol/L组的细胞成功诱导为成熟MN，而0~1 μmol/L组因细胞数量太少难以形成成熟MN。

综上所述，在神经分化的早期应用GSK3抑制剂，可以促进细胞的增殖，浓度≤3 μmol/L对NSC的分化效率无影响。同时，在分化早期加入≤3 μmol/L的GSK3抑制剂，且在定向分化开始前撤去，可发挥稳定分化后期神经元、提高分化效率的作用，并最终促使细胞分化为成熟MN。综合考量，分化早期加入3 μmol/L的CHIR最利于MN的分化。