流感病毒属于正黏病毒科，是单股负链RNA病毒，按照病毒核蛋白和基质蛋白的抗原性不同，分为甲、乙、丙3型。其中甲型流感病毒变异快、毒力强，其感染流行是全球范围内引起危重疾病和死亡的重要原因。近年高致病性甲型H5N1和H7N9流感病毒株在亚洲人群中时有流行，病死率高，且有介导人与人间相互传播的潜在可能，对全球健康造成极大的威胁[1]。甲型流感病毒不仅可以引起重症感染，还有少见的并发症，先前有甲型H1N1流感病毒感染合并噬血细胞综合征的报道[2]。甲型流感病毒入侵机体后，其组成蛋白和核酸等作为病原体相关分子模式(PAMP)可被机体免疫系统中模式识别受体(PRR)识别，引起固有免疫反应，介导炎症，严重者可引组织器官的免疫病理损伤[3]。NOD样受体(NLR)是重要的细胞内PRR，可活化组装形成炎症小体，从而诱导IL-1β、IL-18等促炎因子的分泌，在抗甲型流感病毒的固有免疫中发挥重要作用，目前已有较多研究[4-5]。但在细胞水平，甲型流感病毒感染不同时间后炎症小体信号通路的激活程度和IL-1β等炎症因子的分泌有何变化，目前国内外研究较少。本研究以小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7为对象，以甲型流感病毒鼠肺适应株H1N1/FM1分别感染6 h和1周，观察NLRP3炎症小体信号通路的变化，旨在探讨NLRP3炎症小体信号通路在甲型流感病毒不同感染时间点的作用。
材料与方法 一、 材料 1. 细胞株及甲型流感病毒H1N1/FM1小鼠单核巨噬细胞株RAW264.7购自中国医学科学院基础医学院基础医学细胞中心，甲型流感病毒株H1N1/FM1为暨南大学医学院微生物学与免疫学教研室赠予，冻存于液氮罐中。
2. 主要试剂及仪器DMEM高糖培养基购自Life公司(美国)，胎牛血清购自PAN-Biotech公司(德国)。NLRP3单克隆兔抗体购于Cell Signaling Technology公司(美国)；NLRP3免疫荧光羊抗兔二抗购自R&D公司(美国)；caspase-1单克隆兔抗体购自Novus Biologicals公司(美国)；GAPDH兔抗体和辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗购于广州杰特伟生物科技有限公司
二、 方法 1. 细胞培养按10%胎牛血清比例和DMEM高糖培养基配成完全培养基，于25 ml培养瓶中培养RAW264.7细胞，置于37℃、5%CO2培养箱内，当细胞融合至约70%培养瓶底面积且状态良好时，将细胞用胰酶消化传代，约2~3 d传1次，使实验所用细胞处于其对数生长期。
2. 甲型流感病毒H1N1/FM1株复苏和毒力测定取出甲型流感病毒H1N1/FM1株，置冰盒内复温，用9 d龄鸡胚尿囊腔连续传代2次，测定血凝滴度为1:1 280。用不含血清的DMEM培养基将FM1病毒连续10倍递次稀释到10-8/L。取培养的RAW264.7细胞，胰酶消化后用含血清培养基调整细胞数为2×108/L，96孔板每孔加100 μl，置培养箱培养6~8 h，待细胞贴壁吸弃培养液，加入相应稀释度的甲型流感病毒H1N1/FM1。每个稀释度做6个复孔。培养5~6 d，用Reed-MueNcH法计算病毒的半数组织细胞感染量(TCID50)。
3. 甲型流感病毒H1N1/FM1感染细胞将生长状态良好的RAW264.7细胞稀释为109/L，接种于6孔板，每孔加入完全培养基至2 ml培养，待细胞数增至2×106个时开始感染，根据病毒TCID50的测定结果，每孔加入100 μl的10倍稀释TCID50病毒液。本实验设对照组和实验组:甲型流感病毒H1N1/FM1感染RAW264.7细胞6 h作为对照组，感染细胞1周作为实验组。每组实验重复3次。
4. NLRP3、caspase-1和IL-1β mRNA相对表达量测定采用荧光定量PCR法。查找Gen Bank数据库中上述3种物质和内参β-actin的基因序列，交美国Life公司设计合成特异性引物，引物序列见表 1。收集对照组和实验组细胞，Trizol法提取细胞的总RNA，根据试剂盒说明书操作合成模板DNA。反应体系20 μl，包括模板DNA、SYBR Master Mix、前后引物和DEPC水，置于ABI7500系统进行PCR反应，反应条件为：50℃ 2 min，95℃ 2 min预变性，95℃ 15 s变性，60℃ 1 min退火，共进行40个循环，后95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 30 s，60℃ 15 s延伸。记录目的基因与内参基因的Ct值，以2-ΔCT作为各基因的mRNA相对表达量。
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表 1 目的基因引物序列 |
采用蛋白免疫印迹法检测。收集各组细胞，提取蛋白并测定浓度，每支EP管中加入30 mg蛋白、载样缓冲液和去离子水共30 ml，煮沸10 min待上样。用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳法分离各目的蛋白，90 V恒压电流约30 min，待蛋白标记物(marker)条带清晰分开后，再用110 V恒压继续电泳，至条带接近凝胶底端即停止。选择合适的转膜电压和时间，将目的蛋白转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，再将膜置于含5%牛血清白蛋白(BSA)的孵育盒内，室温封闭1 h，吸弃封闭液后加入相对应的一抗置于4℃摇床过夜，TBST缓冲液洗膜后室温孵育二抗1 h，洗膜后加入ECL发光液，用Chemi Scope化学发光成像系统曝光，Image J软件分析蛋白条带得到灰度值，作为其蛋白相对表达量。
5.2 免疫荧光染色法定性检测NLRP3的蛋白表达根据免疫荧光染色的操作步骤，细胞依次经4%甲醛固定、0.5%TritonX-100通透、5%牛血清白蛋白封闭和NLRP3一抗孵育过夜、避光孵荧光二抗(之后所有步骤均避光操作)、Hoechest33342复染核，每一个步骤之后均用磷酸盐缓冲液洗涤，最后加入防荧光淬灭剂，置于激光共聚焦显微镜下观察荧光强度。
6. 细胞培养上清液中IL-1β的浓度检测采用ELISA检测。收集细胞培养液上清于EP管中，根据R&D公司Mouse IL-1β Valukine ELISA Kit试剂盒的操作说明书检测IL-1β的浓度。
三、 统计学处理用SPSS 20.0进行统计分析。数据以x±s表示，组间比较采用独立样本t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
结果 一、 实验组和对照组细胞培养上清液中的IL-1β分泌水平比较实验组细胞培养上清液中IL-1β的水平高于对照组(t=-4.355，P=0.005)，见图 1。
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图 1 实验组和对照组上清液中的IL-1β浓度比较 组间比较，*P < 0.01 |
NLRP3 mRNA在实验组的相对表达量为1.20±0.17，在对照组为2.35±0.46；caspase-1 mRNA在实验组的相对表达量为1.624±0.029，在对照组为1.133±0.016；IL-1β mRNA在实验组的相对表达量为5.35±1.20，在对照组为2.46±0.24。实验组NLRP3 mRNA相对表达量低于对照组(t=5.744，P < 0.001)，caspase-1和IL-1β mRNA的相对表达量高于对照组(t值分别为36.312、5.785，P均 < 0.001)，见图 2。
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图 2 实验组和对照组的NLRP3、caspase-1和IL-1β的mRNA表达水平比较 组间比较，*P < 0.01 |
NLRP3蛋白在实验组的相对表达量为5 379±415，在对照组为14 731±892，实验组的NLRP3蛋白表达水平低于对照组(t=23.285，P < 0.001)。caspase-1蛋白在实验组的相对表达量为20 643±740，在对照组为13 857±214，cleaved-caspase1蛋白在实验组的相对表达量为3 304±197，在对照组为2 716±179，实验组的caspase-1、cleaved-caspase1的蛋白表达水平均高于对照组(t值分别为21.578、10.380，P均 < 0.001)，见图 3。
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图 3 实验组和对照组的NLRP3、caspase-1、cleaved caspase1的蛋白表达水平比较 A：蛋白免疫印迹结果；B：定量分析结果；组间比较，*P < 0.01 |
实验组的NLRP3蛋白荧光强度低于对照组，表明实验组中NLRP3蛋白表达量低于对照组，与蛋白免疫印迹结果一致，见图 4。
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图 4 实验组和对照组的NLRP3蛋白表达情况(免疫荧光染色，×400) |
天然免疫反应系统是机体抵抗病原微生物入侵的第一道防线。通过PRR识别PAMP或危险相关分子模式(DAMP)等内外源性危险信号，激活下游信号传导通路，引起炎症反应并诱发适应性免疫应答[6]。NLR是一类重要的细胞内PRR，包括3个结构域：C端的亮氨酸富集的重复序列(LRR)，中间段的核苷酸结合寡聚化结构域(NACHT)和N端的半胱天冬蛋白酶激活募集结构域(CARD)或热蛋白结构域(PYD)。NACHT是各NLR成员中唯一同源的结构域。根据NACHT的不同，NLR分成NOD、NLRP/NALP和IPAF 3个亚家族[7]。
炎症小体是由识别蛋白(主要是NLR)、接头蛋白ASC和效应蛋白(主要是caspase-1) 形成的蛋白复合物，该概念最早是在2002年由Tschopp研究团队提出[8]。目前研究最多、阐明最清楚的是NLRP3炎症小体，其激活需要2个信号[9]。第1信号为TLR识别相应配体，通过NF-κB的介导，诱导无活性的pro-IL-1β和pro-IL-18的基因转录和翻译；第2信号为NLRP3识别PAMP或DAMP，诱导形成NLRP3-ASC-caspase-1炎症小体。caspase-1在细胞未受到刺激时，是以无活性的酶原形式存在的，炎症小体形成后，使得酶原以水解的方式构成四聚体，成为有酶切活性的cleaved-caspase-1，其作为炎症小体活化的效应蛋白，剪切无活性的pro-IL-1β为成熟有活性的IL-1β。
甲型流感病毒通过呼吸道入肺后，突破黏膜分泌的黏液层，入侵肺泡上皮细胞、巨噬细胞和树突状细胞[10]。甲型流感病毒的成分如病毒RNA、M2离子通道蛋白和非结构蛋白PB1-F2均可激活上皮细胞和肺泡巨噬细胞中NLRP3炎症小体信号通路，促进IL-1β和IL-18的分泌[11-13]。目前探究NLRP3炎症小体信号通路在甲型流感病毒感染中作用的研究，多采用基因敲除鼠，如NLRP3-/-、caspase-1-/-和IL-1R-/-，在生存率、病毒清除率和肺组织损伤修复的影响方面研究结果不一致，但多是对机体产生有利影响或没有影响，如提高小鼠的生存率，对病毒的清除率没有影响，促进小鼠肺组织的损伤修复等[11, 14-15]。
Tate等[16]运用NLRP3特异性短效抑制剂MCC950来研究NLRP3炎症小体的作用，首次发现NLRP3在病毒感染后期通过增加细胞因子分泌和肺部炎症细胞浸润对机体产生有害作用。
本研究选取甲型流感病毒H1N1作用于小鼠巨噬细胞6 h和1周2个时间点，代表病毒感染前期和后期2个不同阶段。甲型流感病毒H1N1/FM1感染1周相比于感染6 h时，除了NLRP3炎症小体信号通路2中的NLRP3 mRNA和蛋白的相对表达量降低，其余NLRP3信号通路中所检测分子的细胞上清液浓度、mRNA的相对表达量和蛋白表达水平均升高。因为上游因子调控下游因子存在基因转录和翻译的滞后，由此推测，在甲型流感病毒感染后期约1周，其激活NLRP3炎症小体分泌IL-1β促炎因子的强度高于感染早期。
综上所述，我们从细胞水平研究推论甲型流感病毒感染后期NLRP3炎症小体激活和IL-1β促炎因子分泌的强度高于感染早期。NLRP3炎症小体在抗流感病毒感染中，既能发挥保护作用，同时也会由于过度活化导致免疫病理损伤，对机体造成伤害。因此，根据炎症小体在病毒感染不同阶段激活程度的不同，选择合适的时间点对促炎因子的分泌进行干预，将改善甲型流感病毒感染的临床预后，具有重要的意义。本实验对临床干预时间点的选择，从细胞水平提供了重要的依据。目前，仍需要进一步探究甲型流感病毒感染后NLRP3炎症小体的激活和调控机制，为临床治疗甲型流感病毒感染提供新方法。
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