糖尿病肾脏疾病(DKD)是引发终末期肾脏病的主要病因之一，但其发病机制尚未清楚。目前有研究显示，足细胞损伤是DKD进展的中心事件，与肾功能恶化密切相关。有研究者发现，早期DKD患者肾脏中足细胞数量减少，而晚期患者足细胞数量减少更明显[1]。线粒体是细胞有氧代谢的重要枢纽，不仅参与了细胞能量代谢，还在维持铁稳态、调节活性氧自由基(ROS)和调控细胞凋亡等方面起了重要的作用。足细胞具有丰富的线粒体，用以维持肌动蛋白为主的细胞骨架结构，而这些骨架结构是足细胞发挥正常功能的基础。但目前对于DKD时足细胞线粒体功能是否有改变，尚缺乏足够证据。本研究拟通过分离糖尿病小鼠肾脏足细胞，提取足细胞线粒体，检测线粒体功能，探讨足细胞线粒体功能在DKD中的变化。
材料与方法 一、 足细胞分离技术分别采用24周龄的2型糖尿病db/db雄性小鼠及其同窝对照小鼠db/m各6只，db/db小鼠体质量45~55 g，db/m小鼠体质量20~25 g，购自南京大学-南京生物医药研究院。麻醉处死小鼠后，分离肾脏置冰上，切成碎片后置于以下溶液：RPMI 1640+1%青霉素链霉素溶液(PS)+5%胎牛血清+2 mg/ml胶原酶A。震荡后滤过的溶液离心去上清，加入1×的小鼠裂解缓冲液(Sigma)室温放置10 min。再加入10 ml Hank’s平衡溶液(HBSS)中和裂解液，离心去上清液后加入以下溶液：RPMI 1640+PS+5%胎牛血清+0.5 mg/ml胶原酶/分散酶和0.075%胰酶。滤过后离心去上清液并加入以下溶液：MACS溶液和牛血清白蛋白(BSA)溶液按40:1比例配置(标记缓冲液)，然后加入Biotynlated-Podocalyxin抗体和Biotynlated-Kirrel2(Neph3) 抗体。孵育45 min后离心去上清液重复1次；清洗DynabeadsⓇM280链霉亲和素磁珠后加入标记缓冲液和离心后的细胞，置于4℃摇床上孵育45 min。离心去上清液后加入标记缓冲液。将离心管放置在多功能磁性分离架上收集足细胞。取得小鼠足细胞样本进行后续实验检测，实验重复3次。
二、 线粒体分离技术细胞线粒体分离试剂盒购自碧云天生物公司。步骤简述如下：用胰酶消化细胞，离心收集细胞。细胞600×g、4℃离心5 min后作沉淀。弃上清液后加入1~2.5 ml线粒体分离试剂至细胞中，轻轻悬浮细胞，冰浴放置10~15 min。把细胞悬液转移到一适当大小的玻璃匀浆器中，匀浆10~30次。把细胞匀浆在600×g、4℃离心10 min。把上清液转移到另一离心管中，11 000×g、4℃离心10 min后去除上清。沉淀即为分离得到的细胞线粒体。
三、 线粒体复合物活性检测分离足细胞线粒体，分别使用MitoSciences的线粒体复合物Ⅰ和复合物Ⅲ酶活性检测试剂盒检测线粒体呼吸链复合物的活性。
四、 线粒体DNA拷贝数检测使用DNeasy Tissue Kit(Qiagen)提取足细胞总DNA，实时定量PCR(RT-PCR)分别检测小鼠线粒体ND1和CytB DNA, 以及小鼠核H19 DNA。计算ND1:H19和CytB:H19比值。
五、 线粒体代谢相关基因检测将足细胞加入Trizol中提取总RNA后使用TAKARA逆转录试剂盒转录为cDNA, 再使用TAKARA PCR反应试剂进行RT-PCR, 取得结果采用最大二阶导数法分析目的基因SIRT1、PGC-1α、TFAM、NRF1、NRF2的mRNA相对表达量。
六、 免疫组织化学检查(免疫组化)将小鼠肾脏石蜡切片脱蜡至水，用3%过氧化氢室温孵育以消除内源性过氧化物酶的活性。清洗后用10%正常山羊血清(磷酸缓冲盐稀释)封闭1 h，去封闭液后加抗WT1抗体(Santa Cruz)工作液于4 ℃过夜。第2日用PBS冲洗后，加入二抗室温孵育1 h，使用Vectastain@ABC试剂盒(Vector)进行显色镜下观察，检测足细胞标记物nephrin的表达。根据WT1的位置和阳性染色，鉴定细胞，并在随机选择的动物肾切片中，对每只动物的10个肾小球进行足细胞总计数。
七、 统计学处理使用SPSS 22.0统计学软件处理数据。计量资料以x±s表示。组间比较使用t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
结果 一、 db/db小鼠足细胞中的线粒体复合物活性降低24周龄小鼠足细胞线粒体复合物活性检测结果发现，db/db小鼠与db/m小鼠相比，足细胞线粒体复合物Ⅰ活性明显下降(t=21.695，P=0.002，见图 1A)，此外，足细胞线粒体复合物Ⅲ活性也有所下降(t=4.396，P=0.048，见图 1B)。
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图 1 24周龄db/m小鼠及db/db小鼠肾脏足细胞线粒体中的线粒体复合物Ⅰ及Ⅲ的活性检测 *为P < 0.05，**为P < 0.01 |
从24周龄小鼠肾脏中提取足细胞并分析其线粒体复合物组分的基因表达，结果可见，与db/db小鼠比较，db/db小鼠的足细胞线粒体复合物Ⅰ组分mt-ND1及NDUFB2的mRNA表达水平明显下降(mt-ND1：t=18.771，P=0.003；NDUFB2：t= 31.344，P < 0.001，见图 2A)；线粒体复合物Ⅲ组分Uqcrb和Uqcrc1的mRNA表达也明显降低(Uqcrb:t=8.264，P=0.014；Uqcrc1：t=21.047，P=0.002，见图 2B)。
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图 2 24周龄db/m小鼠及db/db小鼠足细胞中的线粒体复合物Ⅰ和Ⅲ组分的基因表达 *为P < 0.05，**为P < 0.01，***为P < 0.001 |
从24周龄的db/m和db/db小鼠肾脏足细胞中提取DNA，RT-PCR分别检测小鼠线粒体ND1和CytB DNA，以及小鼠核H19 DNA。结果显示，db/db小鼠的CytB/H19及ND1/H19比值均较db/m小鼠低(CytB/H19:t=4.459，P=0.047；ND1/H19：t=4.608，P=0.044，见图 3A, 3B)，以上结果证明了糖尿病小鼠足细胞线粒体的DNA拷贝数量下降。
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图 3 24周龄db/m小鼠及db/db小鼠肾脏足细胞中的线粒体DNA拷贝数表达 *为P < 0.05 |
检测24周龄的db/m和db/db小鼠足细胞线粒体代谢相关基因mRNA表达情况，结果显示相比db/m小鼠，db/db小鼠中SIRT1、PGC-1α、TFAM、NRF1、NRF2的mRNA表达均下降(SIRT1：t=10.589，P=0.009；PGC-1α：t=9.648，P=0.011；TFAM：t=12.491，P=0.006；NRF1：t=9.624，P=0.011；NRF2：t=5.308，P=0.034，见图 4)。
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图 4 24周龄db/db小鼠相比db/m小鼠足细胞中的线粒体代谢相关基因mRNA表达 *为P < 0.05，**为P < 0.01 |
检测db/m和db/db小鼠足细胞中足细胞标记物nephrin的表达，结果显示，与db/m小鼠相比，24周龄的db/db小鼠nephrin表达下降(t= 4.716，P=0.042，见图 5A)。而24周龄小鼠肾脏中的足细胞用WT1标记，免疫组化示db/db小鼠的足细胞数量较db/m小鼠的少(见图 5B)。以上均表明了db/db小鼠中的足细胞数量减少。
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图 5 24周龄db/m小鼠及db/db小鼠肾脏足细胞检测图 A：肾脏足细胞nephrin mRNA表达，*为P < 0.05；B：WT1免疫组化染色显示足细胞的数量(×400) |
本研究选用自发性2型糖尿病db/db小鼠作为糖尿病动物模型，db/m小鼠(糖尿病db/db小鼠同窝对照组小鼠)作为对照。db/db小鼠在12~18周龄时出现早期DKD的表现，尿蛋白逐渐增加，伴有肾小球和肾小管损伤，以及肾脏纤维化，而db/m小鼠尿蛋白正常，无类似肾脏病理损害表现。本研究结果显示，db/db小鼠足细胞存在明显的线粒体功能障碍。从db/db小鼠肾脏中分离足细胞，并从足细胞中提取线粒体，检测线粒体功能，结果显示db/db小鼠足细胞线粒体复合物Ⅰ和复合物Ⅲ功能明显下降。此外还发现部分线粒体复合物相关基因mRNA表达下降，伴有mtDNA拷贝数明显降低和足细胞数量减少。进一步研究发现，与db/m小鼠相比，db/db小鼠足细胞与线粒体代谢相关的基因，如SIRT1、PGC-1α、TFAM、NRF1、NRF2 mRNA表达明显降低。以上结果证实，糖尿病小鼠足细胞线粒体功能存在明显异常。
DKD的发生发展是多因素综合作用的结果，目前认为，肾脏血流动力学的改变、代谢紊乱、炎症反应以及遗传背景等均起非常重要的作用。持续高血糖环境引起的大量细胞因子的释放、蛋白激酶C的活化、ROS的产生在DKD的发展中起着至关重要的作用[2-3]，而这些致病因素导致足细胞损伤被认为是引起蛋白尿和肾小球硬化最为重要的因素之一[4-5]。
足细胞是肾小球滤过膜的重要组成部分，在维持滤过屏障的完整、修复基底膜、合成血管内皮生长因子和调节细胞外基质的合成中发挥重要作用。有研究提示，抑制线粒体分裂可以减轻糖尿病小鼠足细胞线粒体功能障碍，改善肾脏病变。足细胞特异性动力相关蛋白1(DRP1) 缺失的糖尿病小鼠中，尿蛋白较对照组的野生型糖尿病小鼠减少，超微结构分析表明野生型糖尿病小鼠的足细胞线粒体分裂现象显著增加，但在足细胞DRP1缺失的糖尿病小鼠中线粒体结构明显改善[6]。电镜观察足细胞线粒体形态学发现，db/db小鼠足细胞线粒体嵴结构明显异常。线粒体嵴是线粒体内膜向线粒体基质折褶形成的一种结构。线粒体嵴的形成增大了线粒体内膜的表面积。同时，线粒体嵴上存在ATP合成酶和细胞色素等重要蛋白，是细胞有氧呼吸的重要场所。但导致足细胞线粒体嵴形态异常的机制目前尚未明确，有待进一步研究。
线粒体形态异常通常伴有功能障碍。有体外研究发现，长时间高浓度葡萄糖刺激小鼠足细胞，可以增加足细胞耗氧量和线粒体数量，下调线粒体复合物Ⅰ+Ⅲ的活性[7]。我们通过分离db/db小鼠足细胞，进一步确认了糖尿病小鼠足细胞线粒体复合物功能较非糖尿病小鼠下降。而且结果证实线粒体复合物Ⅰ和复合物Ⅲ的部分组分mRNA表达明显减少，与线粒体能量代谢密切相关的SIRT1、PGC-1α、NRF1、NRF2及TFAM mRNA表达也明显减少。
由此可见，线粒体功能异常参与了足细胞的损伤过程。线粒体是真核细胞内的重要细胞器，不仅是供应细胞能量的主要来源，而且在调控细胞凋亡、维持铁稳态和调节ROS的生成与清除中具有重要作用。足细胞具有丰富的线粒体，通过电镜可以观察到，除了细胞体外，狭窄的足突部位同样有线粒体的存在。大量的线粒体除了支持足细胞的高能量需求，还参与了足细胞钙信号调节和氧化还原稳态的维持。我们的研究显示，足细胞线粒体功能存在明显异常，可能是DKD足细胞损伤的机制之一。
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