骨肉瘤是骨科最常见的原发性恶性肿瘤，好发于儿童及青少年，具有较高的致残率和病死率。骨肉瘤组织中细胞恶性增殖以及新生血管形成是导致病情进展的重要生物学行为，多种增殖分子以及血管新生分子参与了细胞增殖以及新生血管形成过程的调控^[1-2]。但是，增殖分子以及血管新生分子的上游调控分子目前仍未明确。Runt相关转录因子3(RUNX3) 是Runt相关转录因子家族的成员之一，由α亚单位和β亚单位构成，能够靶向结合DNA序列并调节基因的转录和表达，进而发挥相应的生物学效应^[3]。近年来关于RUNX3的研究显示该转录因子具有抑癌基因的活性，在多种恶性肿瘤中呈低表达趋势并且参与恶性肿瘤病灶中细胞增殖、血管新生过程的调控^[4-5]。尽管如此，RUNX3是否参与骨肉瘤病灶中细胞增殖、血管新生过程的调控仍未见明确报道。在本研究中，我们通过转染小干扰RNA(siRNA)的方式沉默骨肉瘤细胞中RUNX3的表达，进而分析沉默RUNX3对骨肉瘤细胞增殖能力及血管新生能力的影响。

骨肉瘤HEK293细胞株购买于中国科学院上海细胞库，DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶均购买于Gibco公司，siRNA由上海吉玛公司合成，转染试剂盒为Lipofectamine^TM2000脂质体、购买于Invitrogen公司；MTS细胞活力检测试剂盒购买于Promega公司，RNA抽提试剂盒、互补DNA(cDNA)第一链合成试剂盒、荧光定量PCR试剂盒购买于北京康为世纪生物公司，ELISA试剂盒购买于上海西唐生物公司，RIPA蛋白裂解液及BCA蛋白定量试剂盒购买于上海碧云天生物公司。

骨肉瘤HEK293细胞株复苏后用含有5%胎牛血清的DMEM培养基培养，2~3 d更换1次培养基，待细胞密度生长至80%~90%后用胰蛋白酶进行消化传代，传代后将细胞接种在细胞板中并用于转染siRNA，根据转染siRNA不同分为阴性对照-siRNA组(NC组)和RUNX3-siRNA组(RUNX3组)，NC组转染阴性对照siRNA、RUNX3组转染RUNX3-siRNA。

将用于细胞活力检测的细胞接种在96孔细胞板中，分别于转染siRNA后6、12、24、48 h向培养孔内加入MTS细胞活力检测试剂盒的检测液20 μl，在培养箱中继续孵育3~4 h，而后在酶标仪上读取450 nm波长处的吸光值，以该吸光值作为细胞增殖活力值。

将用于细胞活力检测的细胞接种在12孔细胞板中，分别于转染siRNA后24、48 h弃去培养基、收集细胞，采用RNA抽提试剂盒和cDNA第一链合成试剂盒进行实验，分离提取细胞中的总RNA并逆转录合成为cDNA；而后采用酶联免疫吸附试剂盒对cDNA样本进行扩增，扩增的基因分别为β-链蛋白、细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、增殖细胞核抗原(PCNA)以及β-actin，以β-actin为内参、计算细胞中β-链蛋白、CyclinD1、PCNA的mRNA表达量。

将用于细胞活力检测的细胞接种在24孔细胞板中，分别于转染siRNA后24、48 h收集培养基并采用ELISA试剂盒测定血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(bFGF)、促血管生成素-2(Ang-2) 的含量；保留细胞、加入蛋白裂解液并充分裂解细胞，采用BCA蛋白定量试剂盒测定细胞裂解液中总蛋白的含量。计算每mg总蛋白中VEGF、bFGF、Ang-2的含量。

采用SPSS 20.0软件录入细胞增殖活力、增殖分子mRNA表达量、血管新生分子含量的数据并进行分析，计量数据以x±s表示，组间上述数据的分析采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

转染siRNA后6、12、24、48 h，RUNX3组的细胞增殖活力值均高于NC组(P均＜0.05)，见图 1。

图 1

图 1 RUNX3组与NC组转染siRNA后细胞增殖活力值变化 2组的细胞在转染siRNA后6、12、24、48 h增殖活力值均在上升，但RUNX3组的细胞增殖活力值始终高于NC组，与NC组比较，*P＜0.05

转染siRNA后24、48 h，RUNX3组细胞中β-链蛋白、CyclinD1、PCNA的mRNA表达量均高于NC组(P均＜0.05)，见表 2。

表 2

表 2 RUNX3组与NC组转染siRNA后增殖分子的mRNA表达量(x±s) /β-actin 组别 转染后24 h 转染后48 h β-链蛋白 CyclinD1 PCNA β-链蛋白 CyclinD1 PCNA RUNX3组 1.95±0.25 2.24±0.37 2.09±0.29 2.82±0.41 3.18±0.48 2.91±0.44 NC组 1.00±0.15 1.00±0.14 1.00±0.17 1.42±0.20 1.39±0.17 1.46±0.18 t值 6.517 6.269 6.485 6.138 7.030 6.100 P值 < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001

表 2 RUNX3组与NC组转染siRNA后增殖分子的mRNA表达量(x±s)

转染siRNA后24、48 h RUNX3组细胞培养基中VEGF、bFGF、Ang-2的含量均高于NC组(P均＜0.05)，见表 3。

表 3

表 3 RUNX3组与NC组转染siRNA后培养基中血管新生分子含量(x±s) ng/mg总蛋白 组别 转染后24 h 转染后48 h VEGF bFGF Ang-2 VEGF bFGF Ang-2 RUNX3组 7.94±0.92 6.42±0.89 2.58±0.41 10.28±1.84 8.87±1.04 3.93±0.56 NC组 3.06±0.51 3.31±0.46 1.16±0.17 3.9±0.58 5.21±0.78 1.87±0.27 t值 9.278 6.209 6.399 6.614 5.631 6.627 P值 < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001

表 3 RUNX3组与NC组转染siRNA后培养基中血管新生分子含量(x±s)

细胞增殖以及血管新生是骨肉瘤重要的生物学行为，也是造成骨肉瘤组织原位生长以及远处转移的生物学基础。目前，关于骨肉瘤组织中细胞增殖以及血管新生的关键调控分子尚未明确。RUNX3是具有抑癌基因特性的转录因子，由α亚单位和β亚单位构成，与DNA序列结合后能够调控多种基因的表达，进而发挥相应的生物学效应。已有研究显示，在胃癌、结肠癌、乳腺癌组织中RUNX3呈低表达趋势且参与病情的发展变化^[4-6]。但是，关于RUNX3在骨肉瘤发生和发展中所发挥的作用尚未见报道。为了明确RUNX3在骨肉瘤的病情发展变化过程中是否发挥了抑癌基因的作用，我们采用siRNA转染的方式来沉默骨肉瘤细胞中RUNX3的表达，进而对细胞增殖活力进行了分析，结果显示：转染siRNA后6、12、24、4 h RUNX3组细胞的增殖活力均高于NC组，提示RUNX3具有抑癌基因特性，沉默RUNX3表达能够削弱其抑癌基因的活性，继而促进骨肉瘤细胞的增殖。

RUNX3分子结构中的α亚单位含有S型折叠的RD结构域并且能与DNA序列相互结合，β亚单位则能增强α亚单位与相应DNA的结合。RUNX3与DNA序列结合后能够调节相应DNA的转录过程^[7]。β-链蛋白是受RUNX3调节的重要分子，RUNX3能够减少β-链蛋白表达、抑制其与T细胞因子4(TCF4) 形成复合物，进而影响下游细胞增殖相关基因CyclinD1、PCNA的表达^[8-9]。CyclinD1是调控细胞周期进程的分子，与细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)4、CDK6形成复合物后能够加速细胞周期发展、促进细胞增殖；PCNA是调节DNA复制以及细胞周期进程的分子，一方面能够作为DNA聚合酶的辅助蛋白来促进DNA复制，另一方面能够与细胞周期蛋白相互作用并促进细胞周期的发展，进而促进细胞增殖^[10]。我们的研究显示，转染siRNA后24、48 h RUNX3组细胞中β-链蛋白、CyclinD1、PCNA的mRNA表达量高于NC组，这提示RUNX3对骨肉瘤细胞中β-链蛋白及下游CyclinD1、PCNA的表达具有抑制作用，沉默RUNX3能够增加β-链蛋白、CyclinD1、PCNA的表达，进而促进细胞的增殖。

在骨肉瘤病灶血管新生的过程中，血管内皮细胞、成纤维细胞的增殖是新生血管形成的基础。已有研究证实，VEGF、bFGF、Ang-2是调节血管内皮细胞、成纤维细胞生长以及血管新生过程的重要分子^[11-12]。VEGF是目前已知促血管新生功能最强大的细胞因子，能够促进内皮细胞增殖以及血管结构的形成，在肿瘤新生血管形成过程中发挥关键作用；bFGF对成纤维细胞的增殖以及内皮细胞的增殖均有调控作用，能够诱导内皮细胞形成管腔结构、成纤维细胞形成血管支持结构；Ang-2是血管生成素家族中参与新生血管发生的成员，具有确切的促血管新生作用^[13]。我们的研究显示，转染siRNA后24、48 h RUNX3组细胞培养基中VEGF、bFGF、Ang-2的含量均高于NC组，这提示RUNX3对骨肉瘤细胞中血管新生分子VEGF、bFGF、Ang-2的生成具有抑制作用，沉默RUNX3能够增加VEGF、bFGF、Ang-2的生成，进而促进血管新生过程。

综上所述，我们认为，RUNX3在骨肉瘤的病情发展变化过程中具有抑癌基因活性，沉默RUNX3能够增强骨肉瘤细胞的增殖能力及血管新生能力。