糖尿病是一种严重危害公众健康的慢性代谢性疾病，累及全身多个器官，致死率和致残率高^[1]。糖尿病肾病(DN)是糖尿病常见的微血管并发症，也是引起糖尿病患者死亡的主要原因之一^[2]。微小RNA(miR)是一种内源性非编码的小分子RNA，通过碱基配对与靶mRNA的3’-非翻译区结合，形成RNA诱导的基因沉默复合体(RISC)，降解靶mRNA或阻遏其转录后翻译，抑制基因表达^[3]。研究已证实，miR在个体发育、组织分化、细胞增殖和细胞凋亡等多种生理和病理过程发挥调控作用^[4-5]。既往多项研究显示，多种miR在肾脏表达，并且其异常调控与肾脏功能失调和肾脏疾病密切相关^[6-7]。尤其是近几年，miR在DN发生、发展过程中的重要作用受到了广泛关注。已发现miR-135b在糖尿病患者血清中高表达，但miR-135b在DN中的表达及作用未见报道^[6]。为此，本研究探讨miR-135b在DN发病中的表达水平、作用及机制，现报告如下。

本研究的肾组织病理蜡块来源于广州市第一人民医院病理科。本研究经医院伦理委员会批准。人肾小管上皮细胞株HK-2和人系膜细胞株HMC均购于美国ATCC公司。

miR-135b模拟物、miR-135b抑制物及has-miR-135b和U6的引物均购于广州锐博生物公司。miR Vana^TM PARlSTM Kit购于美国ABI生物公司。iScrip^TM cDNA Synthsis Kit购于美国BIO-RAD生物公司。Q-PCR的SYBR Green Mix Kit购于日本Takara公司。葡萄糖、甘露醇均购于美国Sigma公司。双荧光素酶报告基因的载体pmiR-RB-REPORTTM vector及人源Smad5 3’-非翻译区的WT及MUT克隆均购于广州锐博生物公司。双荧光素酶报告基因检测试剂盒购于美国Sigma公司。原位杂交试剂盒购于美国Exiqon公司。小鼠抗Smad5单克隆抗体、小鼠抗p21单克隆抗体购于美国CST公司。小鼠抗β-actin单克隆抗体、山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG购于美国Santa Cruz公司；小鼠抗Fibronectin单克隆抗体、小鼠抗Collagen Ⅰ(Col Ⅰ)单克隆抗体购于美国BD公司; 小鼠抗PCNA单克隆抗体、兔抗细胞周期蛋白D1(CyclinD1) 多克隆抗体购于美国Abcam公司。

采用实时定量PCR检测miR-135b在DN肾组织中的表达，对照来自于临床肾癌切除时选取的远离癌旁的正常肾组织，另外采用正常培养(含5.5 mmol/L葡萄糖)、甘露醇高渗(5.5 mmol/L葡萄糖加19.5 mmol/L甘露醇)培养和高糖(30 mmol/L葡萄糖)培养HMC及HK-2细胞12、24、48 h，各组均有6份样品，每份样品重复检测3次。先利用miR Vana^TM PARlSTM Kit提取包括miR在内的总RNA。采用iScrip^TM cDNA Synthsis Kit逆转录为模板DNA，然后使用SYBR Green Mix Kit进行定量PCR，每份样本设3个复孔，具体按说明书操作。所有反应均应用ABI 7500实时定量PCR仪完成。

采用原位杂交法，取DN肾组织及正常肾组织石蜡标本切片，常规脱蜡至水，3%H₂O₂室温作用10 min，水洗2次，然后加入3%柠檬酸2 ml和4滴胃蛋白酶浓缩液，混匀，37℃消化10~20 min暴露miR片段。磷酸盐缓冲液水洗后依次按照原位杂交试剂盒说明书步骤进行预杂交和杂交，然后依次封闭、滴加生物素化鼠抗地高辛置室温1 h、滴加生物素化过氧化酶置室温30 min、二氨联苯胺(DAB)显色并苏木素染核。使用AxioVision Rel.4.6(Carl Zeiss)拍摄图像。采用生物信息学预测miR-135b的靶基因，生物信息学预测网站miRanda:http://www.microrna.org; PicTar:http://pictar.mdc-berlin.de/ http://www.microrna.org; PicTar:http://pictar.mdc-berlin.de/; Targetscan：http://www.targetscan.org/。

利用Primer 5软件设计人源Smad5基因(NM_001001419.2)3’-非翻译区的引物，两端分别引入XhoI和EcoRI的酶切位点序列，提取HMC细胞基因组DNA，进行PCR扩增并克隆人Smad5基因的3’-非翻译区，序列测定确认后，将片段插入到荧光素酶报告载体pGL3-Basic的MCS区域，构建Smad5荧光素酶报告野生型基因载体pGL3-Smad5-wt。同时采用类似的方法构建突变型基因载体pGL3-Smad5-mut，仅将预测的miR-135b的结合位点AAAGCCA突变为UUUCGGU，使miR-135b与Smad5 3’-非翻译区不能互补。

分别设为miR-135b+pGL3、miR-135b+pGL3-Smad5-wt(20、50 nmol/L)、miR-135b+pGL3-Smad5-mut(20、50 nmol/L)组，每组设6个复孔，分别加入各组转染好的HMC及HK-2细胞，在6孔板中每孔加入1倍稀释的裂解液250 μl，室温下轻轻振摇20 min，摇匀后把裂解物转吸至EP管中，高速离心30 s。把上清转至新的EP管中，检测荧光素酶活性：在50 μl的底物溶液1(荧光素酶分析试剂Ⅱ)内加入10 μl细胞裂解液，用枪尖轻轻混匀2~3次(每个样品混匀的次数一致)后加仪器内检测。取出检测管，加入50 μl Stop & Glo试剂，混合后检测双荧光素酶报告基因活性，记录比值，保存数据。分析数据时将对照组归一化，比较实验组与对照组的报告基因活性。

分别在HMC和HK-2细胞中转染空白载体、miR-135b模拟物和miR-135b抑制物，浓度均为50 nmol/L，48 h后采用蛋白免疫印迹法检测Smad5的蛋白表达。收集转染好的HE-2和HMC细胞裂解液，冰中静置30 min，离心，取上清，加蛋白载样缓冲液，煮沸10 min，瞬时高速离心，分别取不同样品的总蛋白50 μg经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶电泳后，转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用5%脱脂奶粉溶液室温封闭1 h，加入相应的抗体，4℃过夜。洗膜后，再加辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，室温孵育1 h，洗膜后进行显色，曝光于X线胶片上，图像分析系统进行灰度扫描，用Image J分析软件将图片上每个特异条带灰度值数字化。以β-actin为内参，用目的蛋白条带灰度值与内参灰度值的比值代表目的蛋白的相对表达含量。同法检测HMC的细胞周期和细胞外基质相关蛋白的表达水平，包括增殖核抗原(PCNA)、Cyclin D1、细胞周期蛋白依赖性激酶的抑制蛋白p21、纤维粘连蛋白Fibronectin和胶原成分Col I。

采用SPSS 17.0分析数据。计量资料以x±s表示。2组样本均数的比较采用t检验。多组间样本均数的比较采用单因素方差分析，多组间的两两比较采用LSD-t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

实时定量PCR显示，miR-135b在DN肾组织中表达较正常肾组织升高(P < 0.05)，见图 1A。原位杂交显示，miR-135b在DN肾组织中表达较正常肾组织增强，且其表达主要位于肾小球系膜细胞及肾小管上皮细胞的胞浆和胞核中，见图 1B。高糖培养的HMC及HK-2在24 h时均能上调miR-135b的表达，48 h升高更显著，与同时点正常对照及甘露醇高渗培养的HMC及HK-2比较差异均有统计学意义(P均 < 0.05)，见图 1C~D。

图 1

图 1 miR-135b在DN肾组织及高糖刺激条件下的表达情况 A：实时定量PCR，与正常肾组织比较，*P < 0.05；B：原位杂交，箭头所示为miR-135b在DN肾组织的表达及定位；C：实时定量PCR，miR-135b在HMC正常培养、甘露醇高渗培养及高糖培养条件下中的表达，与正常培养及甘露醇高渗培养比较，*P﹤0.05；D:实时定量PCR，miR-135b在HK-2正常培养、甘露醇高渗培养及高糖培养条件下中的表达，与正常培养及甘露醇高渗培养比较，*P < 0.05

生物信息学显示，人源和鼠源的Smad5 3’-非翻译区与miR-135b种子序列的8个碱基UUUCGGUA完全互补，见图 2A。miR-135b模拟物可下调Smad5的蛋白表达水平，而miR-135b抑制物对Smad5的蛋白表达无影响，见图 2B。Smad5 3’-非翻译区的荧光素酶报告基因载体见图 2C。将Smad5 3’-非翻译区野生型和突变型质粒分别转染入HMC及HK-2，并同时转染miR-135b模拟物，发现miR-135b模拟物能抑制Smad5 3’-非翻译区野生型荧光素酶活性(P均 < 0.05)，但对Smad5 3’-非翻译区突变体的荧光素酶活性无影响(P均>0.05)，见图 2D。

图 2

图 2 miR-135b对Smad5的靶向调控 A：人和鼠源miR-135b的Smad5 3’-非翻译区的结合位点；B：HMC和HK-2细胞中转染空白载体、miR-135b模拟物、miR-135b抑制物后Smad5的蛋白表达情况；C：Smad5 3’-非翻译区的野生型和突变型的序列；D：miR-135b对Smad5 3’-非翻译区野生型和突变型的双荧光素酶活性的影响，与miR-135b+pGL3及miR-135b+pGL3-Smad5-mut比较，*P < 0.05

miR-135b促进系膜细胞增殖及系膜基质增加HMC细胞转染miR-135b模拟物，可有效下调其靶蛋白Smad5的表达，同时上调PCNA和Cyclin D1表达，且使细胞周期蛋白依赖性激酶的抑制蛋白p21表达降低(P均 < 0.05)，但转染miR-135b抑制物对PCNA、Cyclin D1、p21的表达无影响(P均>0.05)。miR-135b可促进纤维粘连蛋白Fibronectin和胶原成分Col I的表达，见图 3。

图 3

图 3 miR-135b对HMC细胞周期和细胞外基质相关蛋白表达的影响 A：miR-135b对Smad5、PCNA、Cyclin D1、p21、Fibronectin和Col I表达影响的蛋白免疫印迹检测结果；B~G：定量分析结果，与无RNA、正常对照及miR-135b抑制物组比较，*P < 0.05

miR在各种组织和细胞中都有表达，且存在组织特异性^[4]。miR-135b具有促进肝癌的侵袭和转移，促进气道炎症介质(白三烯)分泌，通过靶向调控LATS2促进乳腺癌细胞周期进展等作用。目前的研究表明，miR-135b在肝癌、胃癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌等多种肿瘤中呈高表达^[8-12]。miR-135b在肾脏疾病中的表达及作用的相关报道较少。本研究应用实时定量PCR和原位杂交检测DN患者肾组织中miR-135b的表达，发现miR-135b在DN肾组织中表达较对照组升高，且表达主要位于肾小球系膜细胞和肾小管上皮细胞，提示miR-135b可能参与DN的发病过程。

miR是通过与靶基因的3’-非翻译区不完全或者完全互补，降解mRNA或抑制其翻译，进而抑制靶基因的表达。通过目前已有的软件分析发现，1/3的蛋白编码基因可能为miR的靶基因^[3]。本研究利用miRanda、Targetscan和PicTar等生物学信息网站预测分析，发现Smad5是多个数据库共同命中的miR-135b靶基因，并找出其可能结合的位点。Smad5主要通过骨形成蛋白(BMP)受体磷酸化，介导BMP-7信号转导，具有保护肾功能及肾脏纤维化的作用^[13]。本研究通过转染miR-135b的模拟物和抑制物，发现miR-135b与Smad5的表达有关。研究进一步构建Smad5 3’-非翻译区荧光素酶报告基因的野生型载体和突变型载体，并分别转染HMC和HK-2细胞，通过检测荧光素酶活性以明确miR-135b和Smad5的靶向关系。结果显示，miR-135b通过与Smad5的3’-非翻译区特异位点的结合抑制其表达，进一步证实了miR-135b靶向调控Smad5的表达，提示miR-135b可能通过靶向下调Smad5表达促进肾脏纤维化。

DN的主要特征包括：肾小球肥大、肾小球系膜细胞增殖及系膜区细胞外基质增生、肾小球毛细血管基底膜增厚、肾小管间质纤维。本研究使用高糖分别刺激HMC和HK-2细胞，发现均能上调miR-135b的表达。研究并在HMC细胞中转染正常对照、miR-135b模拟物和miR-135b抑制物，发现miR-135b靶向下调Smad5的表达，上调增殖核抗原PCNA和细胞周期蛋白Cyclin D1表达，且使细胞周期蛋白依赖性激酶的抑制蛋白p21表达下调，并且miR-135b还能上调Fibronectin和Col I的表达，使细胞外基质增加。因此，miR-135b可能通过靶向调控Smad5基因促进系膜细胞增殖及肾脏纤维化，研究结果为深入认识DN的发病机制提供了科学依据。