骨关节炎是中老年人的常见病，其发病机制复杂，涉及遗传、机械运动和环境等多种因素。分子机制的研究表明，某些微小RNA(miR)会影响软骨细胞的表型转变、细胞凋亡和基因表达^[1]。骨关节炎的基本病变包括软骨破坏和骨赘形成，骨赘形成主要由成骨细胞完成。miR-335-5p可抑制成骨分化，也可通过2个正反馈环促进鼠间充质干细胞的软骨形成，提示miR-335-5p可能与骨关节炎的发病有关^[2-3]。本研究通过检测miR-335-5p在骨关节炎患者外周血单个核细胞(PBMC)中的表达水平，分析其与骨赘形成之间的关系，探讨骨关节炎发病分子机制中的一个侧面。

选取2014年10月至2015年6月在我院住院或门诊就诊的膝骨关节炎患者50例，其中男13例、女37例，年龄(55.0±10.2) 岁。另选择在我院行健康体检的30名正常人为健康对照组，其中男14名、女16名，年龄(54.6±10.6) 岁。2组的性别构成、年龄比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。膝骨关节炎的诊断基于1986年美国风湿病学会膝骨关节炎分类标准。本研究经过医院伦理委员会批准，并且所有参与者均签署知情同意书。

ABI 7300型荧光定量PCR仪(美国ABI公司)，淋巴细胞分离液(北京鼎国昌盛生物技术公司)，Trizol试剂(美国Life Technologies公司)，TaqMan miR逆转录试剂盒(美国ABI公司)。

依地酸二钠抗凝管收集外周血，分离PBMC。采用Trizol法提取PBMC中RNA，微量分光光度计检测RNA浓度以及纯度。按试剂盒说明书步骤将提取的总miR逆转录成模板DNA。总反应体系共15 μl，其中10倍稀释的逆转录缓冲液1.5 μl、100 mmol/L dNTP 0.15 μl、5 U/μl逆转录酶1 μl、40 U/μl核糖核酸酶抑制剂0.19 μl、5倍稀释的逆转录引物3 μl(具体序列见表 1，产物长度25 bp，由上海英维捷基公司合成)、miR样品1 μl、纯水8.16 μl。反应条件：16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min。对照物U6的逆转录反应条件：37℃ 30 min，85℃ 5 min。取1 μl逆转录产物，用Taqman通用PCR反应混合物和TaqMan miR Assay进行实时定量PCR。反应条件：95℃ 10 min，95℃ 15 s、60℃ 1 min 40个循环，FAM通道，60℃收集荧光。在ABI 7300型荧光定量PCR仪上进行实时荧光定量PCR，每份标本做3个复孔。以PE Biosystem SDS 2.0软件分析Ct值。计算各标本平均Ct值，以小分子RNA U6作为内参，将miR-335-5p的Ct值减去U6的Ct值作为△Ct值。计算标准化后的2^-△Ct值表示miR的相对表达水平。

表 1

表 1 miR-335-5p的PCR引物序列 基因 基因序列 miR-335-5p 正向5’-GAGTTGACCACAGCACCTC-3’ 反向5’-GAGACAGTTCTCGTTATTGC-3’ U6 正向5’-TGGGGTTATACATTGTGAGAGGA-3’ 反向5’-GTGTGCTACGGAGTTCAGAGGTT-3’

表 1 miR-335-5p的PCR引物序列

Kellgren-Lawrence膝骨关节炎的X线分级：① 0级，正常；②Ⅰ级，关节间隙无变窄，可疑骨赘或微小骨赘；③Ⅱ级，关节间隙可疑变窄，有明显的轻度骨赘；④Ⅲ级，关节间隙明显狭窄，骨质有硬化性改变，中度多发骨赘形成；⑤Ⅳ级，关节间隙明显狭窄，严重硬化性改变及明显关节畸形，有大量骨赘形成。

采用SPSS 18.0分析数据。计量资料以x±s表示，组间比较用独立样本t检验，变量间相关性分析采用Pearson线性相关或Spearman秩相关分析。P < 0.05为差异有统计学意义。

miR-335-5p在骨关节炎患者PBMC中的表达水平低于健康对照组(0.00090±0.00008 vs. 0.00278±0.00025，t=4.057，P < 0.001)。

50例骨关节炎患者，年龄(55.0±10.2) 岁、BMI(24.2±3.6) kg/m²，其PBMC中miR-335-5p的表达水平与年龄(r=-0.763，P < 0.001)、BMI(r=-0.440，P < 0.001) 呈负相关。Kellgren-Lawrence的X线分级中，0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级分别有13、30、5、2例，其PBMC中miR-335-5p的表达水平分别为0.00016±0.00002、0.00083±0.00017、0.00637±0.00098、0.00348±0.00034，X线分级与miR-355-5p表达水平无关(P>0.05)。

骨关节炎的发病机制尚未阐明，但Wnt信号通路在其中发挥重要作用。在软骨内的成骨过程中，Wnt信号通过靶基因的表达参与了骨发育和骨重塑的调节^[4]。DKK1是一种分泌蛋白，能够通过与Wnt受体复合体LRP5/6结合抑制Wnt信号通路，导致骨代谢异常^[5]。对骨关节炎的研究发现，在参与调节成骨细胞分化的miR中，靶向DKK1的miR仅有miR-29a和miR-335-5p^[6]。

miR-335在人类定位于7q32.2，可调节人干细胞的增殖、迁移和分化^[7]。有学者认为，miR-335在骨动态平衡中起到重要的调节作用，miR-335-5p可直接靶向DKK1 3’-非翻译区，通过下调DKK1，调节成骨分化^[2]。

笔者前期研究显示，miR-335-5p在骨关节炎患者膝关节液中的表达下调^[8]。本研究显示，miR-335-5p在骨关节炎患者PBMC中的表达下调(P < 0.05)，这种表达降低可能影响其靶基因DKK1和SFRP1的表达，进而作用于Wnt信号通路导致骨代谢异常。Tornero-Esteban等^[9]研究也发现，miR-335在骨关节炎患者的骨髓间充质干细胞(MSC)中表达低于对照组，且认为这种下调是骨关节炎MSC固有的表现，通过Wnt信号通路，影响了骨关节炎的骨生成和矿化。miR是一类在进化上高度保守的非编码小分子单链RNA。在正常状态下，miR的表达具有严格的组织及时序特异性，当miR异常表达时可能导致疾病的发生。因此，骨关节炎患者PBMC中miR-335-5p表达下调，提示miR-335-5p可能与骨关节炎的发病机制相关。

骨关节炎的易感因素包括高龄、肥胖、遗传、性激素、吸烟等，如肥胖和骨关节炎患病率和发病率均呈正相关，降低体质量可减少骨关节炎发生、发展。本研究显示，骨关节炎患者miR-335-5p的表达水平与年龄、BMI呈负相关。这种负相关关系提示骨关节炎患者BMI越大、miR-335-5p表达越低，BMI越小、miR-335-5p表达增加。从这个相关关系而言，miR-335-5p似乎是骨关节炎的一个保护性基因。患者可以通过降低BMI，减轻骨关节炎的症状，但BMI的下降是否会导致miR-335-5p的表达增加，需要进一步研究证实。

Kellgren-Lawrence的X线分级是衡量骨关节炎患者关节损伤和骨赘增生程度的一个重要指标。本研究显示，骨关节炎患者miR-335-5p的相对表达量与Kellgren-Lawrence的X线分级之间无关，提示miR-335-5p虽与骨关节炎相关，但与骨赘形成之间并无直接的关系，提示其不会促进骨赘的形成，进一步支持了前面的假说，即miR-335-5p可能是骨关节炎的一个保护性基因。

综上所述，miR-335-5p在骨关节炎患者PBMC中表达下调，并与骨关节炎患者的年龄、BMI呈负相关，提示miR-335-5p可能是骨关节炎的一个保护性基因，而这种作用是否通过调控靶基因DKK1激活Wnt/β-catenin信号通路参与骨关节炎的发生、发展，是否能成为骨关节炎诊断与治疗的新靶点，尚需进一步研究。