痛风是指尿酸生成增多和(或)排泄减少所致的血尿酸升高，尿酸盐晶体沉积于组织或器官的一组临床综合征。痛风典型的临床表现为受累关节的红、肿、热、痛及功能障碍，甚至出现关节致残及肾衰竭，危害严重。作为痛风急性发作的一线用药，秋水仙碱、NSAID及糖皮质激素(激素)存在着胃肠道、肝肾等不良反应^[1]。因此，开发一种有效、不良反应少的药物是非常必要的。我国传统医学对痛风性关节炎急性发作的治疗以清热利湿、活血泻浊、化淤通络为主，常用四妙方治疗，而土茯苓是四妙散组方中最常见的单味中药，能解毒、除湿、通利关节。我院临床上用土茯苓加四妙散汤剂(加味四妙散汤剂，MSD)治疗急性痛风性关节炎患者发现有效，但其具体机制不详。有研究证实，IL-1β、IL-6及TNF-α等炎症介质在尿酸盐晶体诱导的痛风性关节炎中发挥重要作用^[2-3]。本研究构造急性痛风性关节炎鼠模型，予不同浓度MSD灌胃后观察疗效，并检测关节周围软组织炎症细胞的变化、关节滑液中IL-1β、TNF-α及IL-6炎症介质的变化，从而为MSD治疗急性痛风性关节炎的疗效提供理论依据，也为其可能机制及以后药物的药理、毒理研究提供理论依据。

健康清洁级雄性Wistar大鼠45只，体质量180~220 g，约3月龄。所有大鼠均由川北医学院实验动物中心提供，动物生产许可证号:SCXK (川)2013-18、使用许可证号:SYXK(川)2013-076。分笼饲养，饲养环境室温22~24 ℃，自由饮食、饮水，自然昼夜节律光照，定期更换垫料。标准饲料由川北医学院实验动物中心提供。实验过程中对动物的处置符合相应的伦理学原则。

在无菌的超净台上，用高压灭菌干燥的1.5 ml的离心管，量取2管80 mg的尿酸盐晶体(已制作好，无热源、无内毒素)，用灭菌后的枪头取1 ml的磷酸盐缓冲液(PBS)配成80 mg/ml的混悬液。

实验用药：MSD由5味中草药组成，包括黄柏15 g、苍术15 g、牛膝15 g、薏苡仁30 g、土茯苓30 g，以上中药由南充市泰鹏药业有限公司提供，均为优质生药。根据人与动物及各类动物间药物剂量的换算方法，MSD低、高剂量组分别为正常成人临床用药量的6.25倍、12.5倍。

MSD的煎剂及浓缩：取上述药物共10付，用10倍体积蒸馏水泡30 min后煎煮2次，每次煎约90 min，合并2次水煎液，用高压旋转蒸发仪将其浓缩至233 ml，使生药浓度为4.5 g/ml。

秋水仙碱混悬液的制备：将云南植物药业有限公司生产的秋水仙碱(每片0.5 mg，共20片)用研钵磨碎，将粉末溶于蒸馏水中形成0.01 mg/ml的混悬液。

以上药物经冷却后分装，置于4℃冰箱保存备用。

尿酸钠为美国Sigma公司产品；大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA KIT均购自武汉博士德有限公司。DHP-420电热恒温培育箱(Etrnal永恒公司)；酶标仪(澳大利亚TECAN公司)；-80℃超低温冰箱(香港力康生物医疗科技控股集团)；游标卡尺(永康五金公司)

45只大鼠在开放式实验环境中适应性喂养1周后，随机分为5组，即模型组、空白对照组(BC组)、MSD低剂量组(MSD1组)、MSD高剂量组(MSD2组)、秋水仙碱组(PC组)，每组各9只大鼠。

对大鼠行吸入乙醚麻醉后，在无菌条件下选右踝关节外侧后方为穿刺点，针口斜面朝前上方与胫骨成45度夹角穿入踝关节腔，向BC组大鼠右踝关节注入PBS 50 μl，其余组别大鼠的关节腔均注入50 μl 80 mg/ml的尿酸盐混悬液，以关节囊对侧鼓起为注入标准，随后在关节腔注射部位涂少量红霉素软膏预防感染。尿酸盐注射1 h后，BC组、模型组以生理盐水灌胃，2.5 ml/次，每日1次；MSD1组、MSD2组分别以10.94、21.88 g/(kg·d)的剂量给大鼠灌服加味四妙散汤剂混悬液2.5 ml，每日1次；PC组按0.1 mg/(kg·d)的剂量给大鼠灌服秋水仙碱混悬液2.5 ml，每日1次。治疗期间，各组大鼠均自由饮水及正常饮食。实验过程中，因乙醚麻醉过度有2只大鼠死亡，有3只大鼠因斗殴致外伤感染淘汰。连续给药3 d。

在0、6、24、48、72 h用缚线法于各组大鼠右踝关节的同一部位测量其周长，计算关节肿胀指数，关节肿胀指数= (测定时间点关节周长-初始周长) /初始周长，初始周长即0 h时周长。

末次给药后1 h，在戊巴比妥腹腔注射麻醉下，用颈椎脱臼法将其处死，随后用1 ml PBS对右踝关节腔进行冲洗，收集冲洗液，4℃、12 000转/分离心10 min，取上清液用ELISA法检测各细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平，检测步骤参考试剂盒说明书。

取右侧踝关节，切开关节囊，剥离关节周围软组织，用甲醛溶液固定各组大鼠的关节周围软组织后包埋、切片、行苏木素-伊红(HE)染色，显微镜下观察各组炎症细胞浸润情况。

应用SPSS 17.0对检测结果进行统计学分析。结果以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

模型组在各时点的关节肿胀度均高于BC组(P均 < 0.05)。与BC组相比，模型组大鼠注射尿酸盐后6 h关节肿胀，24 h肿胀达高峰。在注射尿酸盐24 h后，PC组、MSD1组、MSD2组大鼠的关节肿胀度均比模型组降低(P均＜0.05)；MSD1组、MSD2组大鼠的关节肿胀度均高于PC组(P均＜0.05)；MSD2组的关节肿胀度均比MSD 1组降低(P均＜0.05)，见表 1。

表 1

表 1 不同时点5组大鼠的关节肿胀度比较(x±s) % 组别 例数 6 h 24 h 48 h 72 h BC组 8 4.68±1.38 4.07±1.18 1.56±0.81 1.18±0.54 模型组 8 9.32±0.97b 10.05±0.83a 8.49±1.22a 5.21±0.57b PC组 8 9.30±0.89b 4.23±0.46a 2.54±0.50cg 1.95±0.67ad MSD1组 8 9.20±0.69b 7.90±0.38ace 5.95±0.32ce 3.61±0.95bdf MSD2组 8 9.85±0.83b 6.30±0.97aceg 4.02±0.79ceg 2.15±0.65bdh F值 37.99 57.94 98.02 42.65 P值 < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 注：与BC组比较，aP < 0.05、bP < 0.01；与模型组比较，cP＜0.05、dP＜0.01；与PC组比较，eP＜0.05、fP＜0.01；与MSD1组比较，gP＜0.05, hP < 0.01

表 1 不同时点5组大鼠的关节肿胀度比较(x±s)

模型组关节液中的IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平均高于BC组(P均 < 0.05)。给药3 d后，PC组、MSD1组、MSD2组关节液中的IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平均低于模型组(P均＜0.01)。MSD1组、MSD2组与PC组关节液中的IL-1β、IL-6表达水平组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)。MSD1组、MSD2组关节液中的TNF-α表达水平高于PC组(P均＜0.05)，见表 2、图 1。

表 2

表 2 5组大鼠关节液中的炎症因子表达水平比较(x±s) ng/L 组别 例数 IL-1β IL-6 TNF-α BC组 8 95.02±28.79 144.93±24.78 111.81±28.88 模型组 8 202.64±108.77a 281.88±59.64b 638.37±98.02a PC组 8 69.68±26.66c 120.54±31.03d 138.19±36.10c MSD1组 8 111.99±39.18c 161.53±31.16d 232.58±33.51ace MSD2组 8 94.83±46.33cf 140.73±40.76df 262.89±45.45acef F值 6.19 21.27 120.07 P值 0.001 < 0.001 < 0.001 注：与BC组比较，aP < 0.05, bP < 0.01；与模型组比较，cP＜0.05, dP < 0.01；与PC组比较，eP＜0.05;与MSD1组比较，fP < 0.05

表 2 5组大鼠关节液中的炎症因子表达水平比较(x±s)

图 1

图 1 MSD对大鼠急性痛风性关节炎模型关节液中IL-6表达的影响 与BC组比较，*P < 0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与PC组比较，▲P＜0.05

显微镜下观察5组大鼠的关节周围软组织石蜡切片，结果示BC组关节周围软组织未见炎症细胞浸润；模型组关节周围软组织可见大量的炎症细胞浸润，其中以中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞浸润为主，伴有异物巨细胞的形成；MSD1组及MSD2组关节周围软组织炎症细胞浸润较模型组减少；PC组关节周围软组织的炎症细胞浸润较模型组、MSD1组、MSD2组均减少，见图 2。

图 2

图 2 5组大鼠右踝关节周围软组织的炎症细胞表达情况(HE染色，×200) A:模型组; B:BC组; C:PC组; D:MSD1组; E:MSD2组

急性痛风性关节炎是由于尿酸盐晶体沉积在关节及关节周围组织，引起的急性无菌性炎症。作为内源性危险信号，尿酸盐被机体识别，吞噬细胞将其吞噬后可通过破坏溶酶体释放相关蛋白酶、或通过钾离子外流、或产生大量的活性氧簇等方式激活NALP3炎症体，进而分泌、释放成熟的有活性的IL-1β，诱导急性炎症发生。同时，释放到胞外的IL-1β与IL-1R结合，通过激活IL-1信号通路和NF-κB信号通路，募集大量炎症细胞聚集到炎症部位，并产生大量TNF-α、IL-8等炎症细胞因子及趋化因子，引起炎症级联放大效应和尿酸盐沉积处的组织损伤^[4]。多项研究表明，尿酸盐晶体介导IL-1β产生的主要信号通路包括NALP3炎症体依赖的信号通路、Toll样受体依赖的信号通路等^[5-8]。

本研究显示，PC组、MSD1组、MSD2组的关节肿胀度均比模型组低、炎症细胞浸润减少，提示土茯苓加味四妙散同秋水仙碱一样，对尿酸盐诱导的急性痛风性关节炎有疗效。本研究同时显示，PC组、MSD1组、MSD2组大鼠关节液中IL-1β、TNF-α、IL-6表达水平均比模型组低，提示MSD可能通过下调上述炎症细胞因子，起到对抗急性痛风性关节炎炎症反应的作用。MSD1组、MSD2组的IL-1β、IL-6表达水平与PC组均无统计学意义，而MSD1组、MSD2组的TNF-α表达水平比PC组升高，提示MSD抑制IL-1β、IL-6表达的能力与秋水仙碱相近，而MSD对TNF-α表达的抑制能力弱于秋水仙碱。秋水仙碱是痛风的常用治疗药物，然而由于不良反应大，治疗剂量和中毒剂量相近，限制了其临床应用。虽然MSD的作用弱于秋水仙碱，但其相对秋水仙碱而言具有不良反应少、价廉的优势，具有广阔的发展空间。日后下一步研究我们将增加多组剂量疗效间的对比，以探讨最适合的应用剂量。

综上所述，MSD可减轻痛风性关节炎的急性炎症反应，其机制可能为关节液中炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达，进而抑制炎症细胞的聚集，减轻炎症反应。至于MSD通过何种信号通路抑制IL-1β产生仍有待进一步研究探索。