肝癌是我国常见的消化道恶性肿瘤之一，发病率排我国恶性肿瘤第4位，病死率排第3位[1]。肝癌早期发病隐匿，易转移，导致患者手术率低、生存期较短。近几年随着分子靶向药物及微创介入的应用，使得肝癌患者的生存期有所延长，但是相对于其他消化系统肿瘤来说，其疗效仍然不理想，因此寻找新的高效抗癌药物显得尤为重要[2]。
溴结构域蛋白4是BET蛋白家族成员，其可以与组蛋白乙酰化的赖氨酸残基结合，从而招募转录因子影响靶基因表达[3]。JQ1是溴结构域蛋白4的一种抑制剂，可以进入细胞质与溴结构域蛋白4发生竞争性结合，导致溴结构域蛋白4不能与乙酰化的组蛋白结合，进而导致乙酰化的组蛋白不能招募转录调节因子，继而影响相关基因的表达[4]。目前研究发现在非小细胞肺癌、子宫内膜癌、胰腺癌、急性白血病、骨肉瘤、胃癌、结直肠癌等肿瘤中JQ1均可以抑制肿瘤的生长。在肝癌中目前也有相关研究发现JQ1可以通过抑制C-MYC和促进BIM基因表达以达到抑制肝癌细胞的增殖[11]。但是这些仅仅局限在JQ1对肿瘤的增殖方面的影响，本课题从对肝癌转移角度对JQ1的机制进行研究。
材料与方法 一、实验仪器与材料实验使用肝癌细胞株Hep3b、SMMC-7721购于中科院上海细胞库，DMEM培养基、胎牛血清购于美国Life公司，JQ1药物购于美国MCE公司，E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、基质金属蛋白酶(MMP) -9、MMP-2、GAPDH一抗抗体、辣根过氧化物酶标记二抗购于美国CST公司，ECL发光试剂盒购于美国Thermo Fisher公司，青链双抗、matrigel基质胶、纤维连接蛋白(FN)购于美国Life公司，promega MTS one solution测细胞活性试剂盒购于美国Promega公司。
二、方法 1. 细胞培养肝癌细胞株Hep3b、SMMC-7721使用含10%胎牛血清的DMEM培养，DMEM中常规加入含100 U/ml青霉素和0.1 mg/ml的链霉素双抗，肝癌细胞株Hep3b、SMMC-7721置于37℃含5%的CO2常规细胞培养箱中培养。
2. 细胞增殖实验(MTS)取对数生长期肝癌细胞株Hep3b、SMMC-7721，每种细胞分实验组与对照组，实验组加入JQ1药物，浓度分别是2.5、5、7.5、10、15、20 μmol/L，对照组加入DMSO试剂。每种细胞取5 000个，种植于96孔板中，细胞种植后细胞融合率大于50%加入药物，常规培养24 h后，使用MTS检测细胞增殖差异。
3. 细胞迁移实验取对数生长期细胞Hep3b、SMMC-7721，每种30×104个，每种细胞分设实验组与对照组，均种植于6孔板中，常规培养，实验组加入JQ1药物预处理，Hep3b中的JQ1药物工作浓度为2.5 μmol/L，SMMC-7721中的JQ1药物工作浓度为10 μmol/L，对照组加入等量的DMSO，加药常规培养24 h后进行Transwell迁移实验，Transwell小室上室外层预先涂上FN 10 μl，自然晾干，上室中加入含105个细胞无血清DMEM 200 μl，小室外培养基使用含10%胎牛血清DMEM培养基，内外培养基均加入JQ1，药物浓度与预处理细胞浓度一致。加入细胞后常规培养8 h取出，使用棉签擦去未穿过聚碳酸酯膜的细胞，使用含4%多聚甲醛固定10 min，后使用结晶紫染色30 min，使用普通光学显微镜随机拍照，每组取5个视野。
4. 细胞侵袭实验实验分组、细胞处理同细胞迁移实验。Transwell小室外层涂上FN 10 μl，自然晾干后向小室内层加入matrigel基质胶(0.5 μg/UL)50 μl，加入后放于37℃细胞培养箱中30 min，后向Transwell小室上室中加入含105个肝癌细胞无血清DMEM培养基200 μl。小室下室加入完全培养基(10%胎牛血清DMEM)1 ml，常规培养12 h后使用棉签擦去未穿过聚碳酸酯膜的细胞，使用含4%多聚甲醛固定10 min，后使用结晶紫染色30 min，使用普通光学显微镜随机拍照，每组取5个视野。
5. 蛋白免疫印迹法使用加入广谱蛋白酶抑制剂、磷酸化蛋白酶抑制剂的RIPA蛋白裂解液。常规蛋白配平后，上胶使用含4%SDS-PAGE浓缩胶，下胶使用含10%SDS-PAGE分离胶，蛋白上样40 μg，蛋白电泳条件是上胶80 V，分离胶120 V。待蛋白电泳完成后使用TBST清洗3次、每次5 min，后进行蛋白转膜，蛋白转膜条件是：280 MA、转膜2 h。使用含5%脱脂奶粉封闭2 h，封闭完成后使用一抗(1: 1 000) 孵育过夜，后使用TBST清洗3次，每次5 min，后二抗孵育，二抗(1:5 000) 室温孵育4 h。后加入ECL发光液进行曝光。
三、统计学处理实验数据使用SPSS 13.0和GraphPad Prism 6进行统计学处理，两独立样本使用t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
结果 一、JQ1对肝癌细胞的增殖影响使用不同JQ1药物浓度(具体浓度如图 1)，处理肝癌细胞系Hep3b、SMMC-7721，对照组使用加入等量的DMSO，处理24 h后检测细胞增殖情况，发现在SMMC-7721细胞中，实验组(JQ1组)与对照组(DMSO组)相比，当JQ1药物工作浓度达到20 μmol/L时，细胞增殖受到抑制(t=5.00、P < 0.05)，在Hep3B细胞中，实验组(JQ1组)与对照组(DMSO组)相比，当JQ1药物工作浓度达到7.5 μmol/L时，细胞增殖受到抑制(t=14.21、P < 0.05)，并且两种肝癌细胞增殖能力随着药物剂量的增加而下降，见图 1。
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图 1 JQ1对Hep3b、SMMC-7721细胞增殖的影响 |
根据细胞增殖实验的结果，将10 μmol/L作为SMMC-7721细胞处理浓度，将2.5 μmol/L作为Hep3b处理浓度，药物处理24 h后，细胞迁移实验发现，Hep3b实验组(JQ1) 与其对照组(DMSO)相比，肝癌细胞迁移能力增强(t=13.82，P < 0.01), SMMC-7721实验组(加JQ1) 与其对照组相比，迁移能力增强(t=12.84，P < 0.01)，见图 2。
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图 2 JQ1对肝癌细胞Hep3b、SMMC-7721细胞迁移能力的影响 与其对照组(DMSO组)相比，*P < 0.01 |
根据细胞增殖实验的结果，将10 μmol/L作为SMMC-7721细胞处理浓度，将2.5 μmol/L作为Hep3b处理浓度，药物处理24 h后，细胞侵袭实验发现，Hep3b实验组与其对照组(DMSO)相比，肝癌细胞侵袭能力增强(t=22.03，P < 0.01), SMMC-7721实验组与其对照组相比，侵袭能力增强(t=21.18，P < 0.01)，见图 3。
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图 3 JQ1对肝癌细胞Hep3b、SMMC-7721细胞侵袭能力的影响 与其对照组(DMSO组)相比，*P < 0.01 |
使用10 μmol/L JQ1处理SMMC-7721，使用2.5 μmol/L处理Hep3b后，蛋白免疫印迹法检测发现两种细胞系的实验组与对照组相比，MMP-9、MMP-2的蛋白表达量升高，N-cadherin、Vimentin升高，同时P-ERK1/2蛋白表达升高，见图 4。
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图 4 蛋白免疫印迹法检测JQ1对Hep3b、SMMC-7721的E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-9/2蛋白影响 |
为了进一步研究JQ1促进肝癌细胞迁移、侵袭能力增强的机制，将JQ1与P-ERK1/2 (10 μmol/L)抑制剂同时加入肝癌细胞SMMC-7721、Hep3b中，处理24 h，Transwell检测细胞迁移、侵袭的能力的变化，发现Hep3b实验组JQ1+(加入JQ1+P-ERK1/2抑制剂)与其对照组JQ1(只加入JQ1) 相比，迁移能力降低(t=17.90，P < 0.01) 侵袭能力降低(t=23.04，P < 0.01)。SMMC-7721实验组JQ1+(加入JQ1+P-ERK1/2抑制剂)与其对照组JQ1(只加入JQ1) 相比，迁移能力降低(t=8.02，P < 0.01)、侵袭能力降低(t=19.98，P < 0.01)，见图 5及图 6。
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图 5 联合使用JQ1与P-ERK1/2抑制剂对Hep3b、SMMC-7721迁移能力的影响 与其对照组(只加入JQ1) 相比，*P < 0.01 |
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图 6 联合使用JQ1与P-ERK1/2抑制剂对Hep3b、SMMC-7721侵袭能力的影响 与其对照组(只加入JQ1) 相比，*P < 0.01 |
JQ1作为一种BRD4的小分子抑制剂，竞争性的结合到BRD4结构域上，其作用目前也得到了广泛的研究，但是其研究方面主要集中在肿瘤增殖方面，如发现JQ1可以通过抑制PTEN/PI3K/AKT、WNT、YAP/P21/c-Myc信号通路以抑制多种肿瘤的生长[5-6, 8, 12-13]。在抑制肿瘤侵袭转移方面，目前研究较少，目前仅发现在非小细胞肺癌中JQ1可以抑制肿瘤的侵袭转移，在前列腺癌中发现BRD4的过度激活可以促进癌细胞EMT转化，促进肿瘤转移[14-15]。在肝癌中研究发现JQ1可以通过C-MYC抑制肿瘤的增殖，但是在侵袭方面的作用尚不明确。
肝癌的侵袭转移是肝癌手术率低、术后复发的主要原因，目前发现ERK信号通路在肝癌的侵袭转移中占有重要地位，多种促癌基因均可通过激活ERK信号通路促进肿瘤侵袭转移[16-18]。
本研究使用两种肝癌细胞系Hep3b、SMMC-771，使用JQ1处理后，通过Transwell实验检测肝癌细胞的侵袭迁移能力，发现JQ1处理后肝癌细胞侵袭、迁移能力有显著增强，为了探明JQ1对肝癌细胞的迁移、侵袭能力的促进作用，我们通过蛋白免疫印迹法检测EMT相关蛋白及MMP，发现JQ1处理后肝癌细胞的MMP表达升高，同时N-cadherin表达升高，E-cadherin、Vimentin表达下降。同时我们检测了P-ERK1/2表达，发现P-ERK1/2表达显著升高，由于ERK1信号通路在肿瘤的侵袭转移中发挥了重要的作用，使用ERK1/2磷酸化抑制与JQ1同时处理肝癌细胞后发现肝癌细胞的侵袭迁移能力则无显著变化，因此认为在肝癌中JQ1可以通过激活ERK信号通路，促进MMP-9表达，进而促进肝癌细胞侵袭、迁移，但是有研究发现JQ1可以显著抑制肝癌及多种肿瘤的细胞增殖能力[11]。因此在肝癌的相关治疗研究中，可以尝试JQ1联合用药，以降低药物的不良诱导作用，增加抗癌药物的协同效应。
目前研究发现JQ1联合组蛋白乙酰化酶抑制剂帕比司他可增强其对肿瘤的抑制作用，如在神经母细胞瘤中，JQ1联合组蛋白乙酰化酶抑制剂较单独使用JQ1更加显著降低N-MYC的蛋白水平，减慢肿瘤的进程[19]。在急性髓系白血病中，JQ1联合使用组蛋白乙酰化酶抑制剂帕比司他可以显著延长患者的生存期，因此JQ1联合用药实验值得进一步深入探讨，以期为肝癌的治疗提供新的方向[20]。此外对于JQ1促进肝癌细胞侵袭、迁移的分子机制的研究，目前仅仅在体外细胞实验中进行，还有待进一步在动物体内实验进行深入探究。
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