肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其发病率在实体瘤中处于第五位，是第3位的致死性恶性肿瘤[1]。目前，肝癌的治疗方法主要是以手术为主的综合治疗，但肿瘤转移和复发现象仍较常见。近年来有大量研究显示，肝癌的转移和复发与肝癌干细胞密切相关[2]。
肿瘤干细胞是最早由Bonnet等[3]发现的，是肿瘤细胞中极少一部分具有强成瘤性、自我更新、耐药性等特性的细胞，与肿瘤的发生及发展密切相关[4]。研究者陆续在各种肿瘤中找到了肿瘤干细胞，Haraguchi等[5]在2006年首先发现了肝癌干细胞。CD44、CD133、OV6、上皮细胞黏附分子(EPCAM)等均为肝癌干细胞的表面标志物[6-8]。EPCAM又称CD326，与细胞周期、细胞增殖、分化、迁移及免疫逃逸有相关性，大量研究表明它是一种肿瘤干细胞标志物，包括胃癌、结直肠癌及肝癌。由此我们推论诱导肝癌细胞EPCAM表达可以促进肿瘤细胞向干细胞分化。本研究初步结果显示转化生长因子-β(TGF-β)在诱导肝癌细胞上皮细胞间质化(EMT)过程中，可以同时诱导肝癌细胞EPCAM高表达，促进其向干细胞分化，所以我们进一步研究TGF-β通过促进EPCAM表达使肝癌细胞向肝癌干细胞发生分化的机制。
材料与方法 一、主要试剂及细胞培养TGF-β1和β-catenin单克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology公司。EPCAM单抗，β-actin单抗，GAPDH单抗购自美国Santa Cruz公司。荧光二抗Alexa Flour 488、4'，6-联脒-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)染料购自美国Invitrogen公司。人肝癌细胞株(HepG2) 购自中山大学细胞库，培养条件用完全培养基高糖的DMEM+10%胎牛血清(美国Gibco公司)，于5% CO2的培养箱中，37℃常规培养。
二、荧光定量PCR六孔板培养HepG2细胞，加TGF-β1刺激，24 h后用RNA提取试剂盒(美国OMEGA公司)提取细胞总RNA。用逆转录试剂盒(TaKaRa公司)把RNA逆转录成cDNA，加入500 ng模板及其他逆转录试剂，37℃ 15 min，85℃ 15 s。实时PCR反应体系：2 μl cDNA，10 μl SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa公司)，上下游引物各1 μl，补充灭菌双蒸水至20 μl。按TaKaRa说明书调整PCR反应步骤和程序，使用荧光定量PCR仪(Roche公司)进行扩增。E-cadherin引物序列来源于参考文献[12]，GAPDH引物序列来源于参考文献[13]。Vimentin的上游引物：5'-AAAGCGTGGCTGCCAAG-AAC-3'，下游引物：5'-GTGACTGCACCTGTCTCCGGTA-3'。
三、流式细胞仪检测干细胞性消化空白及10 nmol/L的TGF-β1刺激24 h的HepG2细胞，磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗2遍，加入4%的多聚甲醛在室温避光固定40 min，PBS洗1遍，再加入0.2%的Triton X-100通透10 min，PBS洗2遍，加入EPCAM一抗(Santa Cruz)室温孵育1 h，PBS洗3遍，加入荧光二抗Alexa Flour 488(Invitrogen)室温避光孵育1 h，PBS洗3遍后上流式细胞仪(美国贝克曼库尔特公司)检测。
四、蛋白免疫印迹法分析参考文献[14]所述方法，配置10%及8%的SDS-PAGE凝胶后，以每孔20 μg蛋白上样，SDS-PAGE凝胶恒压80 V电泳后，恒流200 mA电转至PVDF膜(购自Bio-Rad)上。5%的脱脂奶粉(PBST配制)封闭2 h后，加入以1:1 000比例与封闭液混合的一抗(EPCAM、β-catenin、β-actin、GAPDH等)溶液，4℃低速振荡孵育过夜。PBST洗涤3次(每次10 min)后，加入辣根过氧化酶标记与封闭液1:5 000混合的二抗(鼎国昌盛生物)，室温摇床低速振荡1.5 h后，PBST洗涤2~3次，加入ECL发光液(购自Thermo)，用X光片曝光。
五、激光共聚焦显微镜观察将HepG2细胞接种到放有盖玻片的6孔板中，培养过夜后细胞爬片，细胞换新鲜培养基，刺激组加入10 nmol/L的TGF-β1，对照组加相应的DMSO，继续培养4 h后冷PBS洗3次，每次5 min，置于4%多聚甲醛中室温固定30 min。PBS洗3次后用1%的Triton X-100通透30 min。PBS洗3次，每次5 min，山羊血清室温封闭2 h，滴加β-catenin抗体(1:100山羊血清稀释)，4℃孵育过夜。PBST洗一次再用PBS洗2次，每次5 min。加入绿色荧光二抗Alexa Fluor 488(Invitrogen，1:500山羊血清稀释)，室温避光孵育1 h，PBST洗1次再用PBS洗2次，每次5 min。滴加10 μg/ml的DAPI染料避光染核10 min，PBS洗3次后甘油封片。在激光共聚焦显微镜(德国卡尔蔡司公司)下观察β-catenin入核情况。
六、干扰试验Negative siRNA和β-catenin siRNA购自锐博公司，将HepG2细胞接种于6孔板中，隔夜培养后，转染以每孔为例：取7.5 μl的siRNA储存液(20 μmol/L)与250 ml的Opti-MEM培养基混合成A液，室温放置5 min，取lipo 2000(Invitrogen公司)5 μl与250 ml的Opti-MEM培养基混合成B液，室温放置5 min，5 min后再把上述A液与B液混合成siRNA-lipo 2000混合液，室温放置20 min，再把siRNA-lipo 2000混合液加入6孔板中，每孔补无血清培养基至2 ml，在37℃、CO2孵箱中孵育6 h，换含10%FBS的培养基培养12 h后，相应的孔加入TGF-β1刺激，对照组不加刺激。我们把HepG2细胞分为a、b、c、d四组：a组转染Negative siRNA，b组转染β-catenin siRNA，c组转染Negative siRNA并用TGF-β刺激24 h，d组转染β-catenin siRNA并用TGF-β刺激24 h。培养24 h后提取总蛋白做蛋白免疫印迹。
七、统计学处理采用SPSS 13.0进行统计学分析。全部数据采用x±s表示，组间比较用独立样本t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
结果 一、TGF-β诱导HepG2细胞形态变化用10 nM的TGF-β诱导HepG2细胞24 h，发现其形态变成长梭形，如图 1A、B。诱导24 h后我们提取其总mRNA做荧光定量PCR，结果显示E-cadherin的mRNA水平下降(t=35.16，P < 0.001)，而Vimentin的mRNA水平上升明显(t=39.53，P < 0.001)，如图 1C、D。10 nM的TGF-β诱导24 h后有60.5%的HepG2细胞EPCAM表达上升，如图 2A；并且提取其总蛋白行蛋白免疫印迹法检测，显示干细胞标志物EPCAM及转录因子β-catenin蛋白表达均上升，如图 2B。同时，荧光定量PCR结果显示干细胞标志物EPCAM(t=58.48，P < 0.001) 及转录因子β-catenin(t=39.55，P < 0.001) 的mRNA亦上升，如图 2C、D。结果示，蛋白与mRNA水平相吻合。
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图 1 HepG2细胞用TGF-β刺激24 h后EMT的形态学变化及其标志物E-cadherin和Vimentin的mRNA变化 A、B：TGF-β刺激24 h后，诱导HepG2细胞EMT的形态学变化；C、D图：刺激HepG2细胞24 h后，EMT标志物E-cadherin和Vimentin的mRNA变化；与0 h比较，*P < 0.05 |
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图 2 HepG2细胞用TGF-β刺激24 h后各指标表达情况 A：TGF-β刺激24 h后，诱导HepG2细胞干细胞标志物EPCAM的阳性表达率；B：TGF-β刺激24 h后，HepG2细胞EPCAM及β-catenin蛋白表达情况；C、D：TGF-β刺激24 h后，HepG2细胞EPCAM及β-catenin的mRNA表达情况；与0 h比较，*P < 0.05 |
前期TGF-β诱导HepG2分化的研究中我们检测多个转录因子：Twist、Zeb、Slug、Snail及β-catenin，发现EPCAM表达上升的同时只有β-catenin表达上升，为进一步明确TGF-β是否诱导β-catenin入核发挥作用，我们使用激光共聚焦检测β-catenin入核情况，TGF-β诱导HepG2细胞6 h后，转录因子β-catenin发生了明显的核转录(图 3)。
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图 3 TGF-β刺激6 h后，HepG2细胞β-catenin入核情况 图中绿色的为β-catenin，蓝色的为细胞核，在HepG2细胞中，对照组β-catenin主要分布在胞质中，加入TGF-β 6 h后，β-catenin明显从胞质转移到细胞核内 |
蛋白免疫印迹法检测干扰β-catenin后，首先，a组与b组比较，发现siRNA干扰β-catenin后，可以导致β-catenin和EPCAM蛋白表达降低，说明干扰有效；其次，c组与a组比较，可以发现TGF-β刺激HepG2细胞24 h后，β-catenin、EPCAM蛋白表达升高，这与之前结果一致，TGF-β可以诱导HepG2细胞发生干细胞化；再者，比较d组与a组，d组在干扰β-catenin的情况下加入TGF-β刺激HepG2细胞24 h后，发现β-catenin、EPCAM蛋白都减少，说明干扰β-catenin可以抑制TGF-β诱导HepG2细胞发生干细胞化，这与我们推测结果一致。
讨论肿瘤的转移和复发是制约肿瘤治疗的一个重要瓶颈，研究显示超过90%的肿瘤患者死亡与肿瘤转移、复发有关，而肝癌具有极强的远处转移能力，术后5年复发率更是高达60% ~90%。因此，探讨肝癌转移和复发的分子机制具有非常深远的意义。目前研究显示，肝癌的转移和复发的分子机制主要集中在：肿瘤干细胞、凋亡逃避(包括EMT、免疫逃逸)及血管生成等方向[15-18]。EMT是上皮细胞丢失上皮细胞表型(如上皮细胞标志物E-cadherin)并获得间质细胞表型(如间质细胞标志物Vimentin)，以获得自由移动能力的过程[19]。
TGF-β是一种具有多功能的多肽类细胞因子，体内几乎所有细胞都能产生TGF-β并存在其受体。TGF-β是由Assoian等[20]在1983年自人血小板中首次发现，并已证实在细胞的生长调节中起重要作用。研究显示，TGF-β对肿瘤发生的早期可以抑制细胞增殖、启动细胞分化、诱导凋亡，但在肿瘤进展期可通过抑制免疫功能、增加血管生成、诱导细胞外基质的产生来促进肿瘤的侵袭与转移。研究显示TGF-β还可以通过诱导肿瘤细胞发生EMT和向干细胞分化来促进肿瘤的侵袭与转移[21-23]。最近研究显示TGF-β还可以诱导肝癌细胞发生EMT过程，这与我们研究结果一致[16]。我们发现使用TGF-β诱导肝癌细胞(HepG2) 形态改变，细胞可转变为长梭形，同时可以诱导HepG2细胞的上皮细胞标志物E-cadherin的mRNA水平下降，间质细胞标志物Vimentin的mRNA水平上升，说明TGF-β是可以诱导肝癌细胞发生EMT过程的(图 1)。
同时，我们通过实验发现，TGF-β可以诱导肝癌细胞的EPCAM表达上升，无论用流式细胞检测还是蛋白免疫印迹法检测都显示TGF-β可以诱导HepG2细胞EPCAM蛋白的上升。最近研究显示EPCAM是肝癌干细胞的表面标志物，由此我们可以认为TGF-β可以诱导HepG2细胞向干细胞分化，为其诱导肝癌细胞侵袭转移提供证据。为进一步明确TGF-β诱导肝癌干细胞的机制我们通过阅读文献发现，EPCAM的表达与Wnt/β-catenin是有密切关系[24]。Wnt/β-catenin信号通路是Wnt信号通路的一个分支，称为经典Wnt信号通路，是细胞内较活跃的信号通路，参与各种干细胞的增殖和分化，主要包括成体干细胞(肝卵圆细胞、造血干细胞、皮肤干细胞和神经干细胞)和肿瘤干细胞(胃癌细胞、结直肠癌和肝癌细胞)等[25-26]。研究显示EPCAM可以作为Wnt/β-catenin的靶基因，而Wnt/β-catenin通路与TGF-β有着协调关系[27]。我们通过研究也发现(图 2)，TGF-β诱导HepG2细胞高表达EPCAM的过程中同时也可以促进β-catenin的高表达；而通过共聚焦检测发现在诱导过程中β-catenin可以发生入核现象(图 3)，我们推测TGF-β可能是通过Wnt/β-catenin的通路诱导肝癌细胞向干细胞分化。我们发现TGF-β诱导HepG2细胞高表达EPCAM的过程可以因为干扰β-catenin表达后受抑制(图 4)，再次验证TGF-β可能是通过Wnt/β-catenin的通路诱导肝癌细胞向干细胞分化。
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图 4 TGF-β刺激及沉默β-catenin后，HepG2细胞的β-catenin、EPCAM蛋白表达的变化 |
综上所述，研究显示TGF-β可以诱导多种肿瘤细胞发生EMT过程，本研究却发现它不但可以诱导肝癌细胞发生EMT过程，而且还可以诱导肝癌细胞向干细胞分化，这为TGF-β诱导肝癌细胞发生复发和转移提供了另一个证据。
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