糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病最常见的微血管并发症之一，已成为工作年龄人群的首位致盲因素^[1-2]。DR早期以视网膜微血管功能障碍为特点, 血管内皮功能障碍参与DR的发生和发展^[3-6]。血管内皮损伤导致白细胞黏附增加，血视网膜屏障破坏，糖尿病黄斑水肿，是糖尿病视力丧失的主要原因^[6]。而炎症反应在DR血管内皮损伤中起重要作用^[6-7]。多种外部刺激，如高糖、胰岛素抵抗、血流紊乱、氧化应激等能导致血管内皮功能障碍，部分是通过激活内质网应激引起，血管内皮细胞内质网应激在糖尿病相关血管并发症中可能起重要作用^[8-10]。而活化转录因子4(ATF4)——内质网应激诱导的转录因子，是DR内皮细胞炎症的关键调节因子^[11]。近年来关于ATF4参与调节内皮细胞炎症及其机制的研究国外已有相关报道，但笔者见国内关于ATF4在糖尿病视网膜内皮炎症中的作用及其机制的相关研究较少，因此探讨了ATF4在调节人视网膜微血管内皮细胞(HRMECs)炎症中所起的作用及其可能的作用机制。

HRMECs细胞、HRMECs细胞专用内皮细胞培养基(ECM)试剂盒(美国Sciencell公司)；二甲基亚砜(DMSO)、甘露醇(美国Sigma-Aldrich公司)；D-葡萄糖、胎牛血清、Opti-MEM培养基、0.25%-乙二胺四乙酸二钠(EDTA) free胰蛋白酶(美国GIBCO公司)；ATF4 siRNA oligo(正义链：5'-CACGUUGGAUGACACUUGUTT-3'，反义链：5'-ACAAGUGUCAUCCAACGUGTT-3'，上海吉玛公司)；Lipofectamine^® 2000 Reagent购自Invitrogen公司；细胞裂解液RIPA购自上海碧云天公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒(美国Thermo Fisher公司)；蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、0.22 μm聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、超敏ECL化学发光检测试剂盒(美国Millipore公司)；山羊抗人TNF-α多抗、兔抗人细胞间黏附因子-1 (ICAM-1) 单抗(美国Santa Cruz公司)；兔抗人β-actin单抗、小鼠抗人IL-1β单抗、兔抗人磷酸化核转录因子-κB p65(p-NF-κB p65) 单抗、兔抗人核转录因子-κB p65(NF-κB p65) 单抗、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗小鼠二抗(美国Cell Signaling Technology公司)；兔抗人ATF4单抗、HRP标记的羊抗兔二抗及兔抗羊二抗、荧光标记的驴抗兔二抗、含4', 6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的封固液(英国Abcam公司)。

HRMECs生长在含5%胎牛血清、1%内皮细胞生长因子、1%青/链霉素的ECM中，置于37 ℃、5%二氧化碳培养箱中培养，2 d换液1次。当细胞融合度达90%左右时进行传代处理。第3~6代处于对数生长期的HRMECs细胞用于实验。

转染前1 d，HRMECs以60% ~70%的密度接种于6孔板中，生长过夜，24 h内细胞汇合达70%~90%。第2日以小干扰RNA(siRNA)：脂质体2000按1:0.05(pmol:μl)的比例进行转染。ATF4 siRNA作为ATF4干扰组，打乱序列(Scrambled)的siRNA作为阴性对照组(Scrambled组)。6-羧基荧光素(6-FAM)标记的siRNA用于在荧光显微镜下观察转染情况。转染过程中使用无血清Opti-MEM培养基，转染4 h后更换为常规培养基ECM。转染24 h后，进行后续高糖处理。

用高糖即培养基中D-葡萄糖浓度为25 mmol/L干预HRMECs。将HRMECs分为正常糖组(5.5 mmol/L D-葡萄糖)、高糖组(25 mmol/L D-葡萄糖)、渗透压对照组(5.5 mmol/L D-葡萄糖+19.5 mmol/L甘露醇)、高糖+ ATF4干扰组、高糖+ Scra-mbled组。各组的高糖或甘露醇干预时间均为24 h。

上述各组细胞经RIPA裂解、离心15~20 min，取上清液用BCA法测定总蛋白浓度后，加入上样缓冲液并煮沸变性保存在-80℃冰箱备用。蛋白经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、湿转法后转移至PVDF膜上。5%脱脂奶粉或5%牛血清白蛋白室温封闭膜1 h后，加入相应抗体于4℃摇床上孵育过夜。第2日膜经相应二抗室温孵育1 h后，将其与ECL发光液室温孵育5 min后置于Bio-rad化学发光成像仪上扫描目的条带。用Image J软件进行分析，以目的蛋白与β-actin条带灰度值之比值表示目的蛋白相对表达水平。测定各组ATF4以及炎症因子TNF-α、ICAM-1、IL-1β、p-NF-κB p65的表达水平。

正常糖组、高糖组、渗透压对照组、高糖+ATF4干扰组用磷酸盐缓冲液(PBS)浸洗后，用4%多聚甲醛室温固定10 min，0.2%曲拉通X-100(TritonX-100) 室温破膜10 min，用1%牛血清白蛋白室温封闭30 min后，用兔抗人NF-κB p65单抗(1:50) 于4 ℃孵育过夜。再用经荧光标记的驴抗兔二抗(1:200) 室温避光孵育1 h，用DAPI染核5 min后，用激光扫描共聚焦显微镜(LSM 780) 观察各组NF-κB p65的表达并拍照。

采用SPSS 20.0进行统计学分析。实验重复3次及以上，计量资料以x±s表示。符合正态分布的两均数比较采用独立样本t检验或单样本t检验，符合正态分布及方差齐性的多组间比较采用单因素方差分析，多组间的两两比较采用LSD-t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

用6-FAM标记的siRNA转染HRMECs 4 h后在荧光显微镜下观察的转染效率见图 1A。用ATF4 siRNA干扰HRMECs中ATF4基因的表达，在RNAi 24 h后提取细胞总蛋白，蛋白免疫印迹法测定ATF4的表达情况，结果显示与Scrambled组相比，ATF4干扰组ATF4的表达较低(t=17.821，P=0.003，图 1B)，提示ATF4蛋白表达水平降低是序列特异性ATF4 siRNA干扰的结果。

图 1

图 1 RNAi对ATF4表达的抑制作用 A：用ATF4 siRNA、scrambled siRNA或FAM标记的siRNA(绿色)转染HRMECs的转染效率荧光图；B：蛋白免疫印迹法半定量分析ATF4沉默效率，*为ATF4干扰组 vs .Scrambled组P < 0.05

与正常糖组相比，高糖组中ATF4以及炎症因子TNF-α、ICAM-1、IL-1β、p-NF-κB p65的蛋白表达水平均上调，比较差异均有统计学意义(LSD-t值分别为-3.720、-5.672、-30.821、-8.693、-10.063，P值分别为0.020、0.005、< 0.001、0.001、0.001)。渗透压对照组与正常糖组的ATF4以及TNF-α、ICAM-1、IL-1β、p-NF-κB p65的蛋白表达水平比较差异均无统计学意义(P均> 0.05)，提示高糖而不是高渗透压诱导HRMECs中ATF4表达增加及发生炎症反应。与高糖+Scrambled组相比，高糖+ATF4干扰组中ATF4以及TNF-α、ICAM-1、IL-1β、p-NF-κB p65的蛋白表达水平均下调，比较差异均有统计学意义(LSD-t值分别为9.030、6.379、8.303、12.159、6.370，P值分别为0.001、0.003、0.001、< 0.001、0.003)，提示敲低ATF4基因可抑制高糖引起的HRMECs中炎症因子TNF-α、ICAM-1、IL-1β、p-NF-κB p65的表达，起到抑制高糖环境下HRMECs炎症反应的作用(图 2)。

图 2

图 2 敲低ATF4抑制高糖诱导HRMECs炎症因子的表达 A：蛋白免疫印迹法检测各组细胞中ATF4各炎症因子的表达情况；B：ATF4相对蛋白水平；C：TNF-α相对蛋白水平；D：ICAM-1相对蛋白水平；E：IL-1β相对蛋白水平；F：p-NF-κB p65相对蛋白水平；*为高糖组vs.正常糖组P < 0.05，#为高糖+ATF4干扰组vs.高糖+Scrambled组P < 0.05

与正常糖组相比，高糖组NF-κB p65(绿色)核转位明显增强，而渗透压对照组NF-κB p65核转位与正常糖组相比无明显差异，表明高糖而不是高渗透压可以诱导HRMECs NF-κB p65的核转位。敲低ATF4基因后，与高糖组相比，高糖+ATF4干扰组中NF-κB p65核转位有所减弱，提示降低ATF4基因的表达可能抑制高糖引起的HRMECs NF-κB p65核转位，从而起到抑制高糖环境下HRMECs炎症反应的作用，见图 3。

图 3

图 3 敲低ATF4抑制高糖诱导的HRMECs NF-κB p65核转位 在激光扫描共聚焦显微镜下观察各组NF-kB p65核转位情况，蓝色代表核，绿色代表NF-kB p65

DR是慢性低度炎症性疾病，炎症反应和内皮功能障碍参与视网膜病变的发生发展，并且独立于视网膜病变的其他危险因素^{[6-7, 12-14]}。本研究采用原代HRMECs，模拟糖尿病患者视网膜血管内皮所处的高糖微环境，用高糖干预HRMECs，发现血管内皮细胞炎症因子表达增多，表明高糖刺激引起HRMECs发生炎症反应，通过体外实验再次验证内皮炎症在DR发病机制中起到突出的作用。减轻炎症活动、改善内皮功能可能可以作为防止或限制DR进展的手段。

内质网在蛋白质的生物合成、正确折叠以及翻译后修饰中起主要作用。当蛋白合成和蛋白折叠平衡被破坏，未折叠和错误折叠蛋白积聚在内质网腔内，便称为内质网应激。此时，细胞启动自适应反应，即未折叠蛋白反应(UPR)，来维持内质网功能和稳态^[15]。尽管UPR在瞬态内质网应激中起重要且有益的作用，但是持续慢性的内质网应激会导致炎症，造成血管内皮损伤和引发相关疾病，持续内质网应激参与包括糖尿病在内的一系列疾病的发生和发展^{[8, 15-16]}。在本研究中，笔者用高糖刺激原代人HRMECs，发现高糖可上调ATF4表达水平，诱导HRMECs炎症因子的产生，而敲低ATF4能抑制高糖诱导的HRMECs炎症因子的产生，提示ATF4在高糖诱导的HRMECs炎症反应中起重要作用。ATF4是UPR中一个双链RNA依赖蛋白激酶样内质网激酶(PERK)的重要转录因子，PERK激活后上调ATF4的表达，最终使ATF4诱导大量基因的表达，其中包括代谢相关基因^[17]。本研究结果为ATF4在DR炎症反应中的关键性调节作用提供了重要依据。

本研究结果显示，高糖诱导HRMECs炎症因子表达增加的同时刺激HRMECs NF-κB p65核转位，而敲低ATF4能抑制高糖诱导的NF-κB核转位，因此我们猜测，ATF4可能通过激活NF-κB p65在高糖诱导的视网膜微血管内皮细胞炎症反应中起重要作用，其可能与DR有关。NF-κB信号通路在诱导和维持疾病炎症状态中起关键作用，NF-κB p65是NF-κB的亚基，当受到多种因素刺激时，NF-κB p65被激活并进入细胞核，诱导靶基因转录，激活炎症信号通路^[18]。内质网应激通过激活NF-κB促进炎症反应，参与许多代谢性和炎症性疾病的发生过程^[19]。ATF4与NF-κB相互关系的研究较少，有研究者用NF-κB抑制剂预处理细胞，然后用腺病毒感染细胞过表达ATF4，结果显示NF-κB抑制剂可减轻过表达ATF4诱导的单核细胞趋化因子-1的分泌，提示ATF4可激活NF-κB诱导单核细胞趋化因子-1的分泌，该研究也为我们的猜测提供了一定依据^[20]。

综上所述，高糖可诱导原代HRMECs发生炎症反应，促进NF-κB p65核转位，而敲低ATF4能减轻高糖诱导的炎症反应和NF-κB p65核转位。提示ATF4在高糖诱导的HRMECs炎症反应中起重要作用，该作用可能通过调节NF-κB的激活来实现，本研究结果为治疗DR提供了一个作用于内皮细胞的可能靶点。