前列腺癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤之一。不同Gleason评分或病理分期的前列腺癌，其病程存在差异，即使为相同组织类型的前列腺癌患者，其临床预后也不尽相同[1]。早期诊治对改善前列腺癌预后十分重要。因此，寻找更有效的前列腺癌诊断标记物是非常迫切的。微小RNA (miR)通过抑制靶基因的翻译而调控着肿瘤的分化、增殖、凋亡、侵袭、转移及耐药等多种生物学行为。既往研究表明，相比正常前列腺组织，miR-205在前列腺细胞癌组织中的表达下调[2]。但是miR-205在前列腺癌中的分子调控机制尚未完全明确。因此，本研究探讨了miR-205对前列腺癌细胞迁移能力的影响及其对靶基因E盒结合锌指蛋白1 (ZEB1) 的作用，现报告如下。
材料与方法 一、细胞株及主要试剂人前列腺癌细胞株(DU145、LNCaP、PC3) 和良性前列腺上皮细胞系(PrEC)购于美国典型菌种保藏中心；胎牛血清、DMEM培养基、胰蛋白酶、乙二胺四乙酸(EDTA)均购自美国Hyclone公司；Has-miR-205模拟物(mimics)和Has-miR-205抑制剂(inhibitor)购自上海吉凯基因化学技术有限公司；Trizol试剂、逆转录试剂盒、SYBR Green荧光定量PCR试剂盒、rTaq DNA聚合酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶Xho Ⅰ和Not Ⅰ均购自日本Takara公司；miR-205引物、U6均由上海蓝基生物科技有限公司合成；SuperECL Plus超敏发光液购于美国Millipore公司；ZEB1、上皮钙黏素(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)抗体购自美国Santa Cruz公司，β-actin抗体、二抗、RIPA细胞裂解液购于上海碧云天公司；脂质体lipofectermine 2000购自美国Invitrogen公司；pGL4荧光载体、双荧光素酶试剂盒购于美国Promega公司；miR提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；Transwell小室购自美国Corning公司。
二、PC3细胞培养、转染及分组PC3细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基中，37℃、5%CO2条件下培养。按Lipofectermine 2000转染试剂说明书步骤转染miR-205 mimics和miR-205 inhibitor。分为miR-205过表达PC3细胞(过表达miR-205) 组、空载体PC3细胞(mimics对照)组、抑制miR-205组和inhibitor对照组。
三、实时荧光定量PCR按照RNA提取试剂盒说明书的步骤提取总RNA，利用紫外线分光光度计检测RNA的浓度与纯度，10 g/L琼脂糖凝胶电泳，逆转录合成模板DNA，实时荧光定量PCR检测miR-205转染前列腺癌细胞PC3后的表达相对定量值(RQ)。miR-205引物序列：上游5'-TCCTTCATTCCACCG-GAGTCTG-3'，下游5'-GCGAGCACAGAATTAAT-ACGAC-3', 产物长度115 bp。内参照U6引物序列为：上游5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游5'-AACGCTTCACGAATT-TGCGT-3'，产物长度96 bp。独立重复试验3次。
四、细胞划痕试验取对数生长期的PC3细胞，置于24孔板，细胞密度8×104/孔，每组设3个复孔，用经消毒的10 μl移液器枪头在24孔板垂直划痕，然后用无血清培养基洗2~3次，于0、24 h在相差显微镜下随机选择5个40倍视野内对划痕面迁移细胞进行计数。
五、Transwell细胞侵袭试验转染48 h后消化细胞，每个Transwell小室上室铺1: 8 Matrigel胶80 μl，接种无血清DMEM培养基重悬PC3细胞液100 μl (含2.5×105个细胞)，下室加入750 μl含20%胎牛血清DMEM培养基，孵箱培养24 h后吸去小室内液体，棉棒擦拭掉上室底部膜表面细胞，4%多聚甲醛固定，0.1%结晶紫染色40 min。荧光显微镜下随机选取5个视野计算穿膜细胞数，取其平均值，以侵袭细胞的数目表示肿瘤的侵袭能力。
六、生物信息学预测microRNA-205的靶基因通过公共生物信息学软件miRanda (http://www.microrna.org/microrna/home.do)预测miR-205可能的靶基因及其作用位点，并结合文献分析。
七、蛋白免疫印迹法检测ZEB1及E-cadherin和Vimentin的表达水平对培养的细胞经RIPA裂解液冰上裂解细胞30 min后，低温离心10 min后吸取上清液测定蛋白浓度。取50 μg蛋白经Bio-Rad电泳仪、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转膜，在5%脱脂奶、1倍TBST、0.05% Tween-20中封闭1 h后，加入1: 1 000稀释的相应抗体4℃孵育过夜。TBST洗膜3次后滴加HRP标记的融合二抗(1: 5 000)，室温孵育2 h，成像，用Quantity One软件分析结果。以各组ZEB1和β-actin蛋白的灰度比值反映样品蛋白的相对表达水平。
八、荧光素酶报告载体的构建及荧光素酶活性检测根据ZEB1基因的3'-非翻译区序列设计合成引物，分别引入限制性内切酶Xho Ⅰ和Not Ⅰ识别位点，引物序列为：上游5'-CAGGCAGATGAAGCAG-GATG-3'；下游5'-CAGCAGTGTCTTGTTGTTGTAG-3'。产物长度以人外周血DNA为模板进行PCR扩增，扩增产物电泳检测，切胶纯化回收，回收产物及pGL4空载体经内切酶Xho Ⅰ和Not Ⅰ双酶切，酶切产物回收，经T4DNA连接酶连接，转化DH5α感受态大肠埃希菌，挑选单克隆菌落，摇菌，提取质粒，行Xho Ⅰ和Not Ⅰ双酶切初步鉴定，测序。在12孔板中种入1×105个PC3细胞，细胞按相应设定组别共转染重组质粒及miR-205 mimics 48 h：以pGL4-ZEB1-3'-非翻译区质粒与miR-205 mimics共转染前列腺癌PC3细胞为试验组，以pGL4-ZEB1-3'-非翻译区质粒与空白对照mimics共转染前列腺癌细胞PC3为对照组，每孔加入荧光素酶试剂盒的细胞裂解液100 μl裂解，取20 μl细胞裂解液加100 μl的LARⅡ，加入100 μl的Stop&Glo试剂，测量荧光值(B)，以萤火虫荧光值(A)作为内参，计算荧光素酶活性值(B/A)。
九、统计学处理使用SPSS 17.0处理数据。计量资料以
良性前列腺细胞系PrEC的miR-205 mRNA的RQ为1.00±0.01，前列腺癌细胞株(DU145、LNCaP、PC3) miR-205 mRNA的RQ分别为0.43±0.07、0.43±0.03和0.18±0.04，前列腺癌细胞的miR-205 mRNA的RQ与上述良性前列腺细胞分别比较差异均有统计学意义(t分别为13.351、28.065和22.817，P均 < 0.001)。由于miR-205 mRNA在PC3的RQ最低，故选择PC3细胞株行进一步研究。
二、4组前列腺癌PC3细胞的miR-205表达情况比较在前列腺癌PC3细胞中，过表达miR-205组的miR-205 RQ为6.12±0.51，高于mimics对照组的RQ (1.00±0.16)，组间比较差异有统计学意义(t=16.784，P < 0.001)；抑制miR-205组miR-205的RQ为0.45±0.01，高于inhibitor对照组的RQ (1.00±0.10)，组间比较差异有统计学意义(t=10.577，P < 0.001)。
三、miR-205的表达水平对前列腺癌PC3细胞迁移及侵袭能力的影响 1. 细胞划痕试验结果24 h后，mimics对照组和过表达miR-205细胞的迁移细胞数目分别为(165.8±19.8) 和(88.1±13.2) 个，过表达miR-205组细胞迁移能力低于mimics对照组(t=5.661，P=0.005)；inhibitor对照组和抑制miR-205组细胞的迁移细胞数目分别为(130.2±28.1) 和(222.1±30.9) 个，抑制miR-205组细胞迁移能力高于inhibitor对照组(t=3.813，P=0.019)，见图 1A。
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图 1 miR-205的表达水平对前列腺癌PC3细胞迁移能力的影响 A：划痕试验；B：Tanswell细胞侵袭性试验 |
24 h后，mimics对照组和过表达miR-205组细胞分别为(250.5±25.1) 个和(125.5±30.7) 个，过表达miR-205组细胞数少于mimics对照组(t=5.456，P=0.005)；inhibitor对照组和抑制miR-205组的侵袭细胞数目分别为(226.9±19.1) 个和(336.3±17.9) 个，抑制miR-205组的侵袭细胞数多于inhibitor对照组(t=7.234，P=0.002)，见图 1B。
四、miR-205对靶基因ZEB1表达的影响 1. 对ZEB1蛋白表达的影响公共生物信息学软件miRanda预测发现，miR-205与ZEB1的3'-非翻译区高度同源配对，提示ZEB1可能为miR-205的靶标基因。蛋白免疫印迹法结果显示，过表达miR-205组和mimics对照组中ZEB1蛋白相对表达水平分别为0.29± 0.03和0.81± 0.16，过表达miR-205组ZEB1蛋白表达水平低于mimics对照组(t=5.418，P=0.006)，见图 2A。
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图 2 miR-205的表达水平对靶基因ZEB1表达的影响 A：蛋白免疫印迹法显示，过表达miR-205组ZEB1蛋白表达水平低于mimics对照组；B：miR-205结合ZEB1位点的预测；C：蛋白免疫印迹法显示，与对照组相比，过表达miR-205组E-cadherin蛋白表达水平高于mimics对照组，其Vimentin蛋白表达水平低于mimics对照组 |
通过Targetscan预测miR-205可能与ZEB1基因3'-非翻译区结合，见图 2B。双荧光素酶报告系统显示，在mimics对照组中，携带野生型3'-非翻译区序列和突变型3'-非翻译区序列载体的PC3细胞荧光素酶活性值分别为1.00±0.07和1.05±0.08，2组间比较差异无统计学意义(P>0.05)；过表达miR-205组中，携带野生型3'-非翻译区序列载体的PC3细胞荧光素酶活性值为0.51±0.06，低于携带突变型3'-非翻译区序列载体的PC3细胞(0.97±0.12，t=5.814、P=0.004)。
3. 对EMT标记物E-cadherin和Vimentin表达的影响蛋白免疫印迹法显示，mimics对照组和过表达miR-205组中E-cadherin蛋白相对表达水平分别为0.19±0.03和0.63±0.23，Vimentin蛋白相对表达水平分别为0.66±0.10和0.08±0.03；与mimics对照组相比，过表达miR-205组E-cadherin蛋白表达水平较高(t=-3.264，P=0.031)，Vimentin蛋白表达水平较低(t=8.798，P=0.001)，见图 2C。
讨论前列腺癌是泌尿系统的恶性肿瘤，晚期转移性的前列腺癌患者治愈率低，由于前列腺癌分子水平存在异质性，前列腺特异抗原(PSA)水平、Gleason水平及病理分级相当的患者具有不同的临床预后，需进一步探寻其诊断分子标志。miR是一类内源性非编码蛋白短链RNA，多项研究表明miR可以通过降解靶基因或抑制靶基因的翻译实现转录后的基因沉默，从而发挥重要的生物学效应，其中包括调控肿瘤的迁移能力等。
越来越多的研究表明，miR在许多肿瘤中是差异表达的，包括前列腺癌[3]。前列腺癌与其他肿瘤一样，miR的表达水平有其特异性：miR-130a和miR-203能够直接作用于雄激素受体(AR)信号通路，这些miR重新表达能够使前列腺癌细胞呈现出类似雄激素剥夺后的形态变化[4]。Ribas等[5]发现AR能直接作用于miR-21的启动子，miR-21表达受抑制后雄激素诱导的前列腺癌AR敏感细胞增殖数量减少，而过表达后这些细胞能够抵抗去势治疗所致的细胞周期停滞。miR-21靶向调控PTEN, 进而激活AKT通路及ERK1/2，促进肿瘤血管生成[6]。
多项研究表明，miR-205基因位于染色体1q32.2，在特定的肿瘤中miR-205能靶向特定基因的表达，既能靶向癌基因，又能靶向抑癌基因，因此表现出了抑癌或促癌的双重功能[7]。miR-205在肿瘤中的作用具有细胞或组织特异性。Greene等[8]发现，小鼠乳腺上皮细胞miR-205通过靶向抑癌基因PTEN促进了肿瘤的发生。然而，更多报道指出miR-205在乳腺癌特别是转移性乳腺癌细胞或组织中表达下调，通过靶向调节HER3及ZEB2等的表达而抑制乳腺癌的增殖和侵袭转移。Gandellini等[9]发现，miR-205在前列腺癌组织中表达下调，并靶向PKCε调控前列腺癌细胞的侵袭，并可能与肿瘤上皮-间质转化(EMT)相关。Hulf等[2]发现miR-205在前列腺癌中存在甲基化并下调表达，其靶标基因MED1因此上调表达并促进前列腺癌进展。Tucci等[10]在前列腺癌阵列研究中发现，p63和miR-205共同形成基因轴，在前列腺癌中表达下调，可预测前列腺癌患者的预后。本研究的迁移和侵袭试验结果表明，外源性上调miR-205表达可以抑制前列腺癌细胞PC3的迁移能力，相反，抑制miR-205表达可以促进前列腺癌细胞PC3的迁移能力，提示miR-205在前列腺癌中可能起着抑癌基因的功能。
EMT是指上皮细胞在形态学上发生向间充质细胞表型的转变，并获得转移能力的过程。研究表明，EMT在前列腺肿瘤侵袭与转移中起着重要作用[11]。E-cadherin表达的变化是EMT过程中一个关键的分子生物学改变，E-cadherin表达的抑制可促进EMT的发生。在EMT发生过程中，E-cadherin表达下调的同时，常伴随有多种间充质相关蛋白的升高，其中较为常见的是Vimentin的表达升高。ZEB家族属于锌指蛋白类，包括ZEB1和ZEB2 (即SIP1)，主要结构特点是其C端和N端都有C2H2锌指簇和位于中间的一段同源结构域。因此，ZEB1和ZEB2有相似的DNA结合特异性，两者均可与E-cadherin的编码基因CDH1的E盒(CACCTG)序列结合，抑制其转录，促进EMT的发生。ZEB1通过对E-cadherin基因的转录抑制，参与EMT的调控[12]。Liangos等[13]研究表明，肿瘤组织中ZEB1的表达量高于癌旁组织，并且ZEB1蛋白在肺腺癌细胞的胞质和胞核中都有表达。
为了探讨miR-205与肿瘤细胞迁移、侵袭能力(特别是EMT)之间的关系，本研究通过公共生物信息学软件预测发现miR-205与ZEB1及的3'-非翻译区序列高度同源配对[14]。因此，以ZEB1基因作为靶基因，采用蛋白免疫印迹法对前列腺癌细胞PC3的ZEB1蛋白水平进行检测，发现miR-205过表达组中ZEB1蛋白水平下降，提示ZEB1可能为miR-205的靶基因，进一步荧光素酶报告试验显示miR-205可以下调ZEB1基因3'-非翻译区质粒的荧光素酶活性，从而证实ZEB1为miR-205的靶基因。蛋白水平验证表明miR-205通过调控ZEB1，抑制E-cadherin以及促进Vimentin蛋白的表达，进一步抑制EMT的发生。由此可见，miR-205通过与靶基因ZEB1 mRNA的3'-非翻译区结合，抑制ZEB1蛋白的翻译，从而抑制EMT的发生，最终抑制前列腺癌细胞PC3的迁移及侵袭能力。
综上所述，miR-205能抑制前列腺癌细胞PC3的迁移及侵袭能力，其机制与下调靶标基因ZEB1表达以及抑制EMT的发生相关，提示miR-205在前列腺癌中可能是一个潜在的肿瘤抑制因子，这为前列腺癌的临床诊断预后和治疗提供新的方向，具有一定的临床意义。
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