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  新医学  2017, Vol. 48 Issue (8): 550-554  DOI: 10.3969/j.issn.0253-9802.2017.08.008
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郑南, 赵和丹, 田华伟, 王金龙, 黄通, 李小玲, 周国强, 刘盛元. 胰岛素信号转导通路相关基因多态性与阿尔茨海默病的关系[J]. 新医学, 2017, 48(8): 550-554.
Zheng Nan, Zhao Hedan, Tian Huawei, Wang Jinlong, Huang Tong, Li Xiaoling, Zhou Guoqiang, Liu Shengyuan. Relationship between insulin signal transduction pathway-associated gene polymorphism and Alzheimer disease[J]. Journal of New Medicine, 2017, 48(8): 550-554.

基金项目

广东省医学科研基金资助项目(A2015387)

通讯作者

刘盛元, E-mail:liushenglb@126.com
Contents              Abstract              Full text              Figures/Tables              PDF
胰岛素信号转导通路相关基因多态性与阿尔茨海默病的关系
郑南, 赵和丹, 田华伟, 王金龙, 黄通, 李小玲, 周国强, 刘盛元     
518033 深圳，中山大学附属第八医院（郑南，田华伟，李小玲，周国强）; 314500 嘉兴，嘉兴市康慈医院心理科（赵和丹，王金龙）; 518030 深圳，深圳市南山区慢性病防治院慢性病防控中心（黄通，刘盛元）; 524001 湛江，广东医学院神经病学研究所，广东省衰老相关心脑疾病重点实验室（刘盛元）
基金项目：广东省医学科研基金资助项目(A2015387)
通讯作者：刘盛元, E-mail:liushenglb@126.com
摘要: 目的 探讨胰岛素信号转导通路相关基因胰岛素磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)多态性与阿尔兹海默病（AD）之间的关系。方法 选择AD患者231例（AD组）、健康对照者231名（健康对照组）为研究对象，提取研究对象外周静脉血全血样本的DNA，通过PCR法和单核苷酸多态性测序检测PI3K多态性，同时利用ELISA检测其血清PI3K的蛋白水平，比较2组PI3K基因型和等位基因分布情况以及PI3K蛋白水平的差异，并分析PI3K多态性rs3730087与PI3K蛋白表达水平的关系。结果 2组PI3K多态性参考ID PIK3R1 rs3730087的各基因型和等位基因以及PI3K蛋白水平比较差异均具统计学意义（P均＜0.05）。2组内不同基因多态性的PI3K蛋白表达水平比较差异均有统计学意义，其中AD组TT和TC比较的P为0.004、TT和CC比较的P为0.016，健康对照组TT和TC比较的P为0.001、TT和CC比较的P为0.022。结论 胰岛素信号转导通路相关基因PI3K多态性与AD有一定关系，PIK3R1 rs3730087（T>C）增加了AD的患病风险。
关键词: 基因多态性    胰岛素信号    阿尔兹海默病    转导通路    
Relationship between insulin signal transduction pathway-associated gene polymorphism and Alzheimer disease
Zheng Nan, Zhao Hedan, Tian Huawei, Wang Jinlong, Huang Tong, Li Xiaoling, Zhou Guoqiang, Liu Shengyuan     
The Eighth Hospital Affiliated to Sun Yat-sen University, Shenzhen 518033, China
Corresponding author: Liu Shengyuan, E-mail:liushenglb@126.com
Abstract: Objective To investigate the relationship between insulin signal transduction pathway-associated gene phosphatidylinositol 3 kinase (PI3K) polymorphism and Alzheimer disease (AD). Methods In this study, 231 AD patients(AD group) and 231 healthy subjects (healthy control group) were recruited. Peripheral venous blood sampling was collected for DNA detection. The gene polymorphism of PI3K was detected by PCR and single nucleotide polymorphism sequencing. The serum level of PI3K protein was measured by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The PI3K genotype, allele distribution and PI3K protein level were statistically compared between two groups. The relationship between PI3K polymorphism rs3730087 and expression level of PI3K protein was analyzed. Results The genotype and allele of PI3K polymorphism reference IDPIK3R1 rs3730087 and the PI3K protein level significantly differed between the AD and healthy control groups (P < 0.05). The expression levels of PI3K protein with varying gene polymorphisms significantly differed between TT and TC (P=0.004), TT and CC in the AD group (P=0.016), TT and TC(P=0.001), TT and CC(P=0.022) in the healthy control group. Conclusions The insulin signal transduction pathway-associated gene PI3K polymorphism exerts certain effect upon AD. PIK3R1 rs3730087 (T>C) increases the risk of AD.
Key words: Gene polymorphism    Insulin signal    Alzheimer disease    Transduction pathway    

随着全球人口老龄化，阿尔兹海默病(AD)的患病率呈逐年上升趋势，随着年龄增加，AD发病率呈指数增长，从60~64岁的0.5%增加到90岁以上的7%，而且据不完全统计，老年人AD的患病率仅次于心血管病和癌症居第3位[1]。与此同时糖尿病在我国老年人群中的发病率也在不断增加，糖尿病有高发病率、高患病率、高致残率的特点，现已成为我国较为突出且严重的公共卫生问题[2]。而大量流行病学研究证实AD与糖尿病之间具有一定的联系，有对照研究显示AD患者中2型糖尿病(T2DM)患病率约为30%，而T2DM患者中AD患病率是正常人群的2~5倍[3]。也有相关的影像学研究显示，T2DM患者的脑室存在增大现象，而脑组织(海马和杏仁核)则存在萎缩现象[4]。由此，本调查以糖尿病相关的重要基因——胰岛素信号转导通路相关基因，也即胰岛素磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)多态性为切入点，研究其与AD的关系。

对象与方法 一、研究对象

2013年1月至2015年6月在中山大学附属第八医院(原广东医学院附属福田医院)及其下设社区卫生服务中心选取的中国汉族患者为研究对象，排除有血管性和混合型痴呆，排除有癌症史、高血压病、心脑血管疾病。患者均经过详细的病史采集、全面体格检查以及神经系统检查、实验室筛查、认知功能评估、头部MRI或CT检查，并由神经内科医师根据精神疾病诊断与统计手册(DSM-Ⅳ)和美国国立神经病、语言交流障碍和卒中研究所——老年性痴呆及相关疾病学会(NINCDS-ADRDA)标准及1999年WHO糖尿病诊断标准进行诊断[5-6]。选取同期在中山大学附属第八医院体检的健康人作为对照，其临床、心理、神经学评估均正常，简易精神状态量表(MMSE)评分>27分。研究对象(具备认知能力)或其亲属(认知能力下降)均签署了知情同意书。该项研究由相关伦理学委员会批准。将入组的研究对象分为AD组及健康对照组。

二、方法

采集研究对象全血用于DNA和蛋白检测。

1. 基因组DNA的提取

将研究对象的200 μl经EDTA-K2抗凝全血以3 000 rpm离心20 min, 弃去血浆，按照QIAamp DNA Blood Mini Kit (QIAGEN)试剂盒使用说明书提取基因组DNA, 取5 μl提取产物进行0.7%琼脂糖凝胶(含0.5 μl/ml溴化乙锭)电泳鉴定，以DNA Marker DL 2000作为DNA分子量标准，在紫外灯下观察产物电泳结果，其余样本置于-80℃冰箱保存备用。

2. 基因型的检测

根据数据库中的公开的单核苷酸多态位点行PI3K基因rs3730087选择，其次要等位基因频率>0.2.应用Primer premier 5引物设计软件进行引物设计，在多态性位点附近100 bp左右区域设计上下游引物，将其序列在美国国立生物技术信息中心(NCBI)数据库中进行比对以确定引物特异性，最后引物序列由上海生工生物有限公司合成，见表 1。

表 1 PI3K基因片段扩增引物表
3. 目的片段的扩增

通过两轮PCR反应获取目的片段，扩增反应体系：2×Taq Unicorn Premix 10 μl，上下游引物各0.3 μl (10 μM)，基因组DNA模板1 μl (25 ng/μl), dd H2O 8.4 μl，共20 μl体系。PCR反应条件如下: 94℃变性4 min, 1个循环；94℃变性20 s，57℃退火20 s，72℃延伸20 s，20个循环；72℃继续延伸3 min, 最后置于4℃终止反应。取1 μl第一轮PCR扩增产物，稀释10倍后作为反应模板，进行第二轮PCR扩增，除模板外PCR扩增反应体系同上。在第2次PCR扩增产物中取5 μl加入上样缓冲液后检验扩增效果，其余扩增产物由华因康生物有限公司采用PSTAR-Ⅱ plus(IDN01-M-P2) 高通量测序进行单核苷酸多态性分析。

4. 血浆PI3K蛋白检测

采用ELISA检测研究对象的血浆PI3K蛋白，所有试剂(人PI3K-ELISA试剂盒，批号BLD0878) 从上海源叶生物科技有限公司购买并严格按照试剂盒说明书要求操作。

三、统计学处理

采用SPSS 20.0统计分析所有数据。计量资料数据符合正态分布时，采用$\overline x \pm s$表示，2组间比较采用t检验，多组间的比较采用方差分析，当多组间差异有统计学意义时，采用LSD-t检验进行两两比较。计数资料采用频数表示，通过检验比较组间变量差别。各组基因频率进行Hardy-Weinberg平衡检验，基因平衡时应用χ2检验分析2组之间基因型的差异。P < 0.05为比较差异有统计学意义。

结果 一、AD组和健康对照组一般情况

本研究中，AD组231例，其中男113例(48.9%)、女118例(51.1%)，年龄(79.6±9.9) 岁；健康对照组231名，其中男113名(48.9%)，女118名(51.1%)，年龄(78.5±8.4) 岁。2组的年龄、教育年限、性别比较差异无统计学意义(P均＞0.05)，具可比性。2组的AD主要遗传风险因子载脂蛋白E4(Apoε4)(+)、MMSE评分比较差异有统计学意义(P均＜0.01)，见表 2。

表 2 AD组与健康对照组一般情况比较
二、AD组及健康对照组PI3K基因型和等位基因的分布情况

2组PI3K基因多态性基因型分布情况见表 2，其多态性参考ID(包括PIK3R1 rs3730087、PIK3R1 rs3730088、PIK3R1 rs3730089) 中，PIK3R1 rs3730088及PIK3R1 rs3730089的各基因型和等位基因，2组比较差异均无统计学意义(P均＞0.05)；而PIK3R1 rs3730087各基因型和等位基因，2组比较差异均具有统计学意义(P均＜0.001)，见表 3。

表 3 AD组与健康对照组PI3K基因型和等位基因的分布情况
三、AD组及健康对照组PI3K蛋白水平的比较

AD组PI3K蛋白水平为(166.1±42.1) mU/L、健康对照组为(177.1±50.7) mU/L，2组比较差异有统计学意义(t=2.537，P=0.011)。

四、PI3K基因多态性rs3730087与PI3K蛋白表达水平的关系

对2组PI3K基因多态性rs3730087与PI3K蛋白表达水平的关系进行对比，结果显示2组内PI3K rs3730087不同基因型的PI3K蛋白表达水平比较差异有统计学意义(P＜0.05)；两两比较结果显示，AD组和健康对照组内TT和TC比较、TT和CC比较，差异均具有统计学意义(P均＜0.05)，见表 4。

表 4 PI3K基因多态性rs3730087与PI3K蛋白表达水平的关系
讨论

AD是老年期痴呆最常见的一种类型，随着我国老龄化的加速，AD已经由一个重要的医学问题转变为社会医学问题，研究者们一直在探索其具体的发病原因及其发病机制，但至今尚未明确，大多数研究均显示其与遗传有关[7]。AD的病理表现以出现老年斑(Aβ蛋白聚集)以及神经纤维缠结(Tau蛋白高度磷酸化)为主[8]。这2种病理表现与胰岛素信号转导通路调控有非常重要的关系，T2DM在一定条件下也能够引发AD，其发生机制可能是由于胰岛素抵抗或分泌不足，使得患者脑组织能量利用障碍，致使正常机体中大脑神经中枢信号的传递被严重扰乱，造成海马代谢异常，使得患者出现进行性认知功能的障碍和记忆损害[9-10]。由此，在本研究中，我们从分子流行病学角度探讨了胰岛素信号转导通路相关基因多态性与AD的关系。

胰岛素在人的机体内作为一种生长因子主要起保护神经并激活树突状细胞、促进其再生与增殖的作用，是人体内无可替代，不可缺少的一种激素[11]。在糖尿病患者体内胰岛素往往分泌不足，这可能与AD有一定关联[12]。于是，研究者猜测胰岛素分泌功能的减退影响了PI3K-AKT转导通路信号，使其出现衰退进而导致胰岛素失去保护作用，使得Aβ蛋白过多积聚和Tau蛋白高度磷酸化[13-14]。我们的研究显示，在PIK3R1 rs3730087各基因型和等位基因中，AD组和健康对照组相比出现了明显差异，这提示在AD的患者中，PIK3R1 rs3730087各基因型和等位基因均出现了明显变化。我们对PI3K蛋白水平进行测量和比较的结果显示，AD组的PI3K蛋白水平较健康对照组低，也就说明了患有AD的患者PI3K蛋白水平确实发生了改变[15]。

在明确了患者PI3K蛋白水平发生变化后，我们从PI3K基因多态性rs3730087与PI3K蛋白表达水平的关系作为切入点，对2组进行了比较分析，发现各组内PI3K rs3730087不同基因多态性的PI3K rs3730087差异较大，其中单纯AD组TT和TC对比、TT和CC对比以及健康对照组TT和TC对比、TT和CC对比均出现显著差异。

综上所述，胰岛素信号转导通路相关基因PIK3R1 rs3730087(T>C)增加了AD患病风险；胰岛素信号转导通路相关基因PIK3R1 rs3730087突变等位基因C表达PI3K蛋白减少；抗胰岛素PI3K-AKT信号转导通路异常作为AD治疗的新切入点，具有极其重要的理论价值和临床意义。

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