胰腺癌主要指胰腺外分泌腺癌，是消化道常见恶性肿瘤，目前其发病率逐年上升。而且胰腺癌的发病隐匿，早期缺乏典型的临床表现，早期诊断困难，5年存活率低^[1-2]。胰腺癌的治疗以手术为主，对放射治疗及化学治疗并不十分敏感。胰腺癌的病因及发病机制尚不明确。因此，研究导致胰腺癌发生发展的主要原因，是一项十分重要的工作。巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)是一种具有谱系特异性的细胞因子，具有调节单核巨噬细胞的增殖分化及刺激巨噬细胞集落形成的作用。M-CSF在营养、代谢调节、器官的发生和组织重建等生理状态下发挥重要作用，M-CSF还与许多肿瘤的发生发展密切相关，在肿瘤细胞增殖、迁移及肿瘤血管形成等过程中发挥重要作用^[3]。但是，M-CSF对胰腺癌BxPC-3细胞迁移、侵袭的作用尚未见报道，本课题主要利用胰腺癌BxPC-3细胞株，研究M-CSF对BxPC-3细胞迁移和侵袭的作用。

BxPC-3细胞株购自中国科学院上海生科院细胞资源中心；M-CSF购自PeproTech公司；Matrigel基质胶购自BD公司；Transwell小室购自广州康龙生物有限公司。

实验前1 d在上、下层小室中加入300 μl无血清的DMEM培养基，放于4℃冰箱中过夜，使膜层水化。第2日，将小室中的培养基吸出，将处于对数生长期的细胞消化成单细胞悬液，将含5×10⁵个细胞的细胞悬液加入上层小室，上层小室DMEM培养基胎牛血清的浓度为1%。在下层小室中加入500 μl含50%胎牛血清的DMEM培养基，实验组将终浓度分别为5、10、20 ng/ml的M-SCF加入下层小室中，对照组将相应体积的无菌磷酸盐缓冲液(PBS)加入到下层小室中，每组设3个复孔。将Tanswell迁移小室放于37℃、5% CO₂培养箱中培养，16 h后取出小室。用4%多聚甲醛固定小室10 min后，用棉签擦去上室未穿孔的细胞，然后用1%结晶紫染色20 min。用PBS清洗，用显微镜拍照，计数每个小室迁移至膜下表面的细胞数，实验重复3次。

实验前1 d在上、下层小室中加入300 μl无血清的DMEM培养基，放于4℃冰箱中过夜，使膜层水化。第2日，在Transwell上室的滤膜上铺上50 μl浓度为0.5 g/L Matrigel基质胶，37℃放置30 min。将处于对数生长期的细胞消化、离心和计数后，用含1%血清的DMEM培养基制成单细胞悬液，每个小室的上层加5×10⁵个细胞。在下层小室中加入500 μl含50%胎牛血清的DMEM培养基，实验组在下层小室中加入终浓度分别为5、10、20 ng/ml的M-SCF，对照组在下层小室中加入相同体积的PBS，每组设3个复孔。将Tanswell迁移小室放于37℃、5% CO₂培养箱中培养，16 h后取出小室。用4%多聚甲醛固定小室10 min后，用棉签擦去上室未穿孔的细胞，然后用1%结晶紫染色20 min。用PBS清洗，用显微镜拍照，计数每个小室迁移至膜下表面的细胞数，实验重复3次。

采用SPSS软件进行统计学分析，Sigmaplot软件做图，多组间比较用方差分析，差异有统计学意义后，用LSD-t检验对所有组进行两两比较。P < 0.05为差异有统计学意义。

将处于对数生长期的BxPC-3细胞消化、制成单细胞悬液后，用Transwell小室检测M-CSF对BxPC-3细胞迁移的作用，在迁移16 h后，发现M-CSF刺激组迁移的细胞数目比对照组多(P=0.013)，而且具有显著的浓度依赖性(见图 1)，以上结果表明M-CSF显著促进了BxPC-3细胞的迁移。

图 1

图 1 M-CSF对胰腺癌BxPC-3细胞迁移的作用(结晶紫染色，×1 000) A：M-CSF组及对照组迁移细胞大体图；B：M-CSF组迁移细胞数目比对照组多，而且具有浓度依赖性；与对照组比较，*P < 0.05，***P < 0.001

将Transwell小室水化后，加入50 μl基质胶，放于37℃使胶凝固。将处于对数生长期的BxPC-3细胞消化、制成单细胞悬液后，将细胞加入小室上层，检测M-CSF对BxPC-3细胞侵袭的作用，16 h后，发现M-CSF组侵袭的细胞数目比对照组多(P=0.037)，而且具有显著的浓度依赖性(见图 2)，以上结果表明M-CSF显著促进了BxPC-3细胞的侵袭。

图 2

图 2 M-CSF对胰腺癌BxPC-3细胞侵袭的作用(结晶紫染色，×200) A：M-CSF组及对照组侵袭细胞大体图；B：M-CSF组侵袭细胞数目明显比对照组多，而且具有浓度依赖性；与对照组比较，*P < 0.05，***P < 0.001

M-CSF是一种具有造血、促进骨吸收、协助胆固醇代谢等作用的细胞因子。M-CSF为链间二硫键连接而成的二聚体糖蛋白，主要存在于骨髓腔内，对单核细胞的增殖、分化及维持其活性具有重要作用。另外，M-CSF可由间质细胞如成纤维细胞、成骨细胞及内皮细胞合成，也可由激活的巨噬细胞、B细胞、T细胞及多种肿瘤细胞合成^[4-5]。一些恶性肿瘤细胞如卵巢癌细胞、子宫内膜细胞癌细胞、结直肠癌细胞等，也能够自发地或刺激后产生M-CSF。

研究已经表明M-CSF与许多肿瘤的发生发展密切相关。卵巢癌患者血清中M-CSF水平明显比正常人高，晚期卵巢癌患者血清中M-CSF水平明显比早期卵巢癌患者高^[6]。M-CSF的血清浓度同非小细胞性肺癌的存活率有关。结直肠癌患者血清中M-CSF的浓度比健康人群血清浓度高，而且与结直肠癌患者的肿瘤分期、淋巴结转移及预后密切相关。另外，结直肠癌患者行根治性手术后血清中M-CSF的浓度显著降低^[7]。M-CSF还与食管癌、多发性骨髓瘤、前列腺癌、妇科肿瘤、乳腺癌以及头颈部肿瘤的发生、发展密切相关^[8-13]。胰腺癌患者血清中M-CSF浓度明显比健康人群血清中的浓度高，说明M-CSF与胰腺癌密切相关^[14]。

M-CSF对胰腺癌BxPC-3细胞迁移、侵袭的作用尚未见报道，本课题主要利用Transwell小室细胞迁移和侵袭实验，研究M-CSF对胰腺癌BxPC-3细胞迁移和侵袭的作用。结果表明M-CSF组迁移和侵袭的细胞数目明显比对照组多，提示M-CSF显著促进了BxPC-3细胞的迁移和侵袭。但M-CSF对胰腺癌的作用机制还不明确，需要进一步探讨。若进一步探讨M-CSF对胰腺癌的作用及其机制，可能对于寻找理想的肿瘤标志物具有重要意义。