Cofilin是普遍存在于真核细胞的一种高度保守的Actin结合蛋白。哺乳动物Cofilin基因有Cofilin-1和Cofilin-2两种亚型。Cofilin-1为non-muscle Cofilin，在除平滑肌、心肌等以外的各型细胞中表达。而Cofilin-2为muscle Cofilin，主要在平滑肌、心肌中表达^[1-2]。Cofilin的基本功能是结合并解聚F-actin、抑制G-actin的聚合。因此，Cofilin-1对于Actin的活性调控是必需的^[1-2]。我们在前期的人冠状动脉内皮细胞自噬蛋白质组学的研究中发现，雷帕霉素能够诱导Cofilin-1的下调。提示Cofilin-1可能参与细胞自噬的过程。本研究拟设计Cofilin-1的小分子干扰RNA(siRNA)，并初步探讨其在细胞自噬中的作用。

材料与方法 一、材料 1. 试剂

siRNA均由Genepharma公司合成；双荧光mRFP-GFP-LC3质粒来自Addgene。转染试剂Lipofectamine3000为Invitrogen公司产品。p-Cofilin-1、Cofilin-1及p62均来自于Cell Signaling公司。LC3B、β-Tubulin分别购自Sigma、Abmart公司。HRP二抗购自Jackson公司。

2. 仪器和耗材

Thermo scientific BCA蛋白定量试剂盒，Biotek Epoch酶标仪，BIO-RAD的电泳仪和转膜仪，荧光显微镜为AMG EVOS fl，Thermo scientific 1300系列A2级生物安全柜，Thermo scientific 3110系列Ⅱ型CO₂培养箱。BIO-RAD蛋白免疫印迹系列耗材。

二、方法 1. 细胞培养

人胚肾细胞HEK293使用添加10%胎牛血清的DMEM培养基，在5%CO₂、37℃饱和湿度下培养，取对数生长期的细胞进行实验。

2. siRNA转染

参照Lipofectamine3000的转染试剂说明书，HEK293细胞生长到约60%~70%密度时进行转染，每对siRNA作为一个实验组，siRNA终浓度为100 nmol/L。转染后细胞继续培养48 h。

3. 蛋白免疫印迹法

转染48 h后收获细胞，各组细胞RIPA裂解液裂解、超声、离心后定量，用8%或12%的SDS-PAGE进行蛋白分离，然后转印到PVDF膜上。封闭后，相应的一抗孵育4 ℃过夜。孵育HRP二抗后进行ECL曝光。

4. 双荧光监测细胞自噬流

按照我们已经报道过的方法进行^[3-4]。siRNA转染HEK293细胞48 h后，双荧光质粒mRFP-GFP-LC3再转染24 h，荧光显微镜下观察细胞内红色荧光、绿色荧光LC3亮点的变化，并随机选取300个细胞进行拍照和统计。统计各实验组平均单个细胞含有的黄色亮点和红色亮点数量。

三、统计学处理

数据采用SPSS 13.0进行分析，多组间比较采用方差分析，多重比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结果 一、自噬时Cofilin-1表达下调

我们在前期用蛋白质组学的方法，系统探索了雷帕霉素诱导人冠状动脉内皮细胞自噬的分子机制。其中，发现一个蛋白斑点的表达下调18.9倍(图 1A-D)。经质谱鉴定该蛋白斑点为Cofilin-1(图 1E)。用蛋白免疫印迹法进行检测，证实雷帕霉素确实诱导人冠状动脉内皮细胞Cofilin-1的下调(图 1F)。

二、Cofilin-1 siRNA的设计

为了干扰Cofilin-1的蛋白表达，我们首先设计Cofilin-1的siRNA。利用在线软件及根据多篇文献的报道，我们设计了三对靶向人Cofilin-1的siRNAs：起始位置分别是483、522及623，见表 1。

三、Cofilin-1参与细胞自噬过程

经过蛋白免疫印迹法，发现siRNA-a(起始位置为483) 及siRNA-b(起始位置为623) 的干扰效果最好。我们进一步研究干扰Cofilin-1后对HEK293细胞自噬的影响。我们观察到有效干扰Cofilin-1的表达后，p62表达下调、LC3Ⅰ向LC3Ⅱ转换(即LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值)增大(图 3A)，并且用红绿双色荧光示踪LC3发现自噬体及自噬溶酶体均增多，即自噬流增加(图 3B、C)。

讨论

为了探索雷帕霉素洗脱支架损伤内皮细胞、进而容易导致支架内血栓形成的分子机制，在前期我们进行了雷帕霉素诱导人冠状动脉内皮细胞自噬的蛋白质组学研究(结果未在此显示)。我们发现其中一个蛋白Cofilin-1的表达急剧下调。事实上，文献里也有类似报道：蛋白质组学研究分别发现etoposide或者resveratrol诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡或者自噬时，Cofilin-1的表达均下调^[5-6]。另外，雷帕霉素或者HBSS诱导MCF-7细胞自噬时，Cofilin-1的表达在自噬小体的不同分离组分具有差异性^[7]。

Cofilin通过调控Actin的活性参与细胞的各种功能过程。Cofilin是Actin行使细胞功能所必需的^[1-2]。研究发现Cofilin在包括胶质细胞瘤、乳腺癌等多种肿瘤组织有高表达^[8-9]。Cofilin是一种重要的肿瘤细胞转移、入侵的调节因子。Cofilin能诱导伪足的形成，确定细胞运动的方向，影响肿瘤细胞侵袭速度。抑制Cofilin活性或者抑制其表达能明显抑制肿瘤细胞的转移入侵。

Actin是细胞中表达量最高的骨架蛋白之一，其参与了细胞的各种功能活动。F-actin聚合对自噬的初始阶段来说是必需的，F-actin网络也参与了自噬体的转运、成熟和降解的全过程^[10]。Cofilin是重要的Actin辅助蛋白之一。Cofilin通过解聚Actin纤丝并结合到其单体上，在维持Actin动态化、重塑细胞骨架中发挥重要作用。Cofilin是Actin行使细胞功能所必需的^[1-2]。基于其功能，我们推测Cofilin-1可能参与了细胞自噬的过程。

本研究结果证实siRNA在有效干扰Cofilin-1的表达后，p62的表达下调、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值增大、自噬流(自噬体及自噬溶酶体)增加。总之，Cofilin-1可能通过调节Actin活性而调控细胞自噬过程。下一步，我们将探讨干预Cofilin-1的作用是否能成为雷帕霉素诱导人冠脉内皮细胞过度自噬的新靶点。