呼吸道合胞病毒(RSV)作为婴幼儿毛细支气管炎最重要的病原体，是诱发婴幼儿反复喘息的常见原因，与哮喘密切相关[1]。IL-8、IL-13、IL-25等炎症因子，可分别通过募集中性粒细胞及嗜酸性粒细胞，参与气道炎症[2]。丙卡特罗作为临床经典药物，能抑制气道高反应性，减少炎症介质的产生和释放[3]。本研究通过建立RSV感染正常人支气管上皮细胞(NHBE)与外周血单个核细胞(PBMC)共培养的体外细胞模型，观察RSV感染对NHBE与PBMC共培养分泌IL-8、IL-13、IL-25水平的变化，以及丙卡特罗药物干预后IL-8、IL-13、IL-25水平的变化，以探讨RSV感染相关性喘息的分子生物学及丙卡特罗治疗的机制。
对象与方法 一、研究对象选择2015年6月至2015年10月在中山大学孙逸仙纪念医院收治的7例毛细支气管炎住院患儿为喘息组，男5例、女2例，月龄(7.8±1.6) 个月，其诊断均符合第8版《诸福堂实用儿科学》标准，喘息均为首次发作，血清及咽拭子RSV-IgM抗体阳性，有湿疹病史6例，排除腺病毒、肺炎支原体、衣原体、巨细胞病毒及单纯疱疹病毒感染者。以同期住院的7例腹股沟斜疝、隐睾择期手术患儿作为对照组，男4例、女3例，月龄(8.0±2.0) 个月，血清RSV-IgM抗体阴性，均无过敏性疾病，且近期无呼吸道感染。2组患儿的性别构成及年龄比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。所有受试者无恶性肿瘤病史及自身免疫病史，近期无糖皮质激素应用史。本研究经中山大学孙逸仙纪念医院医学伦理委员会批准，并征得所有受试者监护人的知情同意。
二、方法 1. 主要试剂丙卡特罗粉剂由浙江大冢制药有限公司提供；用于扩增RSV的人喉癌上皮细胞(Hep-2) 由广州市儿童医院中心试验室提供，NHBE细胞株由广东省人民医院肺癌研究所提供；RSV Long株(A亚型)购自广州博特生物工程责任有限公司；抗RSV鼠单克隆抗体(ab35958) 购自美国ABI公司，ELISA试剂盒(IL-8、IL-13、IL-25) 购自武汉华美科技有限公司。
2. RSV感染NHBE体外模型的建立及鉴定采用MEM培养液(含胎牛血清100 ml/L)，在37℃、5%CO2培养箱中培养NHBE。镜下观察细胞长至70%~80%融合时进行传代。所有试验均采用对数生长期细胞。NHBE以5×104/孔接种于24孔板，每孔培养体积500 μl，待细胞长至80%融合，弃去培养液，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗2次。RSV使用Hep-2细胞进行培养和扩增，采用组织培养半数感染量(TCID50)法测定病毒滴度，方法同本课题组既往研究，以100倍TCID50加入病毒液，33℃吸附2 h后弃去，PBS冲洗3次，加入维持液继续培养24 h[3]。免疫荧光法检测RSV感染后在NHBE胞浆内的表达水平。
3. PBMC的分离收集纳入病例的外周血2 ml(乙二胺四乙酸抗凝)，常规Ficoll密度梯度离心法分离PBMC，采用MEM培养基(1%胎牛血清)于37℃、5%CO2培养箱中培养1 h后，部分细胞贴壁。收集悬浮细胞，滴定为2×106 /ml的细胞悬液。
4. RSV感染及丙卡特罗干预对NHBE与PBMC共培养体系中IL-8、IL-13、IL-25水平的影响试验按PBMC的来源分为喘息组和对照组，分别进行不同处理。其中正常对照组分别采用喘息组PBMC与正常的NHBE共培养、对照组PBMC与正常的NHBE共培养，RSV感染组分别采用喘息组PBMC与RSV感染的NHBE共培养、对照组PBMC与RSV感染的NHBE共培养，丙卡特罗组分别采用喘息组和对照组PBMC与RSV感染的NHBE共培养后，在RSV感染1 h时加入1×10-6 mol/L丙卡特罗。每例标本每种处理均取3个复孔，故每组样本量为21。培养24 h后收集细胞上清，于4℃、3 000转/分离心15 min后转至干净EP管中保存，采用ELISA法检测IL-8、IL-13及IL-25水平，具体操作参照试剂盒操作说明书进行。
三、统计学处理使用SPSS 22.0分析数据。计量资料以x±s表示，2组间比较采用成组t检验，多组间比较先行方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
结果 一、RSV感染NHBE体外模型的建立RSV接种于NHBE后，第2日光学显微镜下可见细胞病变效应，表现为细胞肿胀、变圆、折光性改变、壁厚、胞浆内颗粒增多，使2个或2个以上细胞核分布在1个细胞浆内，形成合胞体。根据课题组前期试验确定100倍TCID50为RSV感染NHBE的最佳条件，RSV以100倍TCID50接种NHBE后，继续培养24 h，应用免疫荧光法，镜下可见RSV接种后，NHBE均可示抗RSV抗体阳性的绿色荧光，且可见合胞体病变，表明RSV感染NHBE模型成功建立，感染后NHBE数量上并无明显变化，少数NHBE形态发生改变。提取PBMC与成功感染的NHBE共培养，24 h后PBMC部分贴壁，数量也有所减少，与PBMC在体外活性下降符合，而NHBE形态更为肿胀、变圆，数量无明显变化，考虑在RSV攻击早期(24 h内)，NHBE主要是形态发生变化，而非凋亡改变，见图 1。
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图 1 RSV感染前后的NHBE细胞形态对比(×100) A：正常NHBE细胞；B：被RSV感染的NHBE均呈绿色荧光，红色箭头所指为合胞体病变；C：RSV感染的NHBE与PMBC共培养0 h，可见PBMC悬浮在培养液上，呈单个或部分抱团；D：RSV感染的NHBE与PMBC共培养24 h，PBMC部分贴壁，数量有所减少，NHBE胞体更为肿胀、变圆 |
喘息组PBMC与正常的NHBE共培养后，其IL-8、IL-13和IL-25水平均高于对照组(P均 < 0.01)，见表 1。喘息组PBMC与RSV感染的NHBE进行共培养，其IL-8、IL-13和IL-25水平亦均高于对照组(P均 < 0.01)，见表 2。经丙卡特罗干预后，喘息组的上述3种炎症因子水平仍高于对照组(P均 < 0.05)，见表 3。
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表 1 喘息组与对照组PBMC与正常NHBE共培养下的炎症因子水平比较(x±s) |
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表 2 喘息组与对照组PBMC与RSV感染的NHBE共培养下炎症因子水平比较(x±s) |
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表 3 丙卡特罗干预RSV感染的共培养体系后喘息组与对照组的炎症因子水平比较(x±s) |
喘息患儿中，对照组、RSV感染组及丙卡特罗干预组的IL-8(F=138.339，P < 0.001)、IL-13(F=438.421，P < 0.001)、IL-25(F=389.223，P < 0.001) 比较差异均有统计学意义。RSV感染组的IL-8、IL-13和IL-25水平均高于对照组(LSD-t分别为6.905、20.327、7.553，P均 < 0.001)；丙卡特罗干预组的IL-8、IL-13水平均低于RSV感染组(LSD-t分别为6.058、20.633，P均 < 0.001)，2组间IL-25水平比较差异无统计学意义(LSD-t=1.134，P=0.264)，见图 2。
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图 2 喘息患儿PBMC和NHBE在不同处理下的炎症因子水平比较 |
毛细支气管炎是2岁以内婴幼儿常见的下呼吸道疾病，主要病原体为RSV，喘憋发作是其特征性表现，重者甚至需要机械通气支持，严重危害患儿的健康[4]。同时，婴幼儿期RSV感染所致的毛细支气管炎和日后哮喘的发生有密切的关系[5]。研究表明，RSV感染致反复喘息及哮喘的发生率可高达50%~92%[6-7]。辅助性T细胞1(Th1)/Th2失衡、Th2细胞占优势仍是发病机制核心。但就重症患者而言，中性粒细胞的浸润加重病情的发展[8]。本研究基于体内RSV感染后气道炎症浸润，建立正常人支气管上皮细胞与PBMC共培养的体外模型，选取经典Th2因子IL-13、新型Th2因子IL-25和中性粒细胞趋化因子IL-8为观察指标，探讨RSV感染的机制。
研究表明，IL-13可通过抑制IL-1β诱导嗜酸细胞活性趋化因子和IL-8的表达，促进气道嗜酸性粒细胞的浸润[9]。另一方面，IL-13还可通过活化Stat6通路促进气道高反应性和杯状细胞增生[10]。新型Th2细胞因子又称为IL-17E，是IL-17家族的成员，主要与受体IL-17RB结合，具有多效性。研究显示，IL-25可上调IL-4、IL-5、IL-13及eotaxin的表达，并促进黏蛋白的分泌，介导Th2应答[11]。Petersen等[12]研究发现，IL-25参与RSV感染相关性肺部疾病，予中和抗体阻断IL-25作用或进行IL-25受体基因敲除，Th2炎症反应可受控。与此同时，IL-25通过诱导IL-8合成在中性粒细胞的趋化和募集作用也备受关注[13]。IL-8激活中性粒细胞，并使之从血液中向组织内游走，与炎症过程的发生、发展密切相关[14]。上述炎症因子在肺部的炎症性疾病如RSV感染和重症哮喘的发病中同样发挥着重要的作用[15]。
本研究显示，毛细支气管炎患儿PBMC与正常的NHBE共培养，此时未受外源性RSV攻击，炎症因子IL-8、IL-13和IL-25水平高于对照组，结合纳入患儿血清和咽拭子均示RSV抗体阳性，表明毛细支气管炎患儿在RSV侵袭时体内已经发生Th2细胞和中性粒细胞的免疫应答，引起气道炎症反应。纳入患儿多数患有湿疹史(6/7)，不排除过敏易感性加剧了嗜酸性粒细胞的募集[16]。
本研究亦显示，RSV感染NHBE后与PBMC共培养后，毛细支气管炎患儿IL-8、IL-13和IL-25表达较对照组增高，同时，RSV感染后IL-8、IL-13和IL-25较感染前分泌增多。表明RSV对于气道上皮细胞的普遍攻击性，通过支气管上皮细胞和淋巴细胞之间的相互作用，尤其喘息组患儿呈现出炎症因子IL-8、IL-13和IL-25瀑布式反应，更多的募集嗜酸性粒细胞和中性粒细胞的浸润、促进黏液分泌和加重气道反应性。
丙卡特罗为临床经典药物之一，是长效选择性β2受体激动剂，与肺组织有较强的亲和力，能抑制乙酰胆碱，松弛支气管平滑肌，改善气道高反应性[17]。同时，丙卡特罗的抗炎作用不容忽视。近来研究发现，β2受体激动剂可活化腺苷酸环化酶，使细胞内cAMP增加，从而活化蛋白激酶A以抑制TNF-α和IL-8的生成[18]。与之相符，本研究予丙卡特罗治疗后，NHBE分泌IL-8水平较前抑制。另一方面，Th2因子IL-13合成也有所下降，考虑丙卡特罗下调机制是通过核因子-κB、p38和JNK-MAPK等多种信号通路，激活肾上腺β2受体-cAMP途径，进而抑制气道上皮细胞分泌Th2细胞因子[19]。
综上所述，RSV感染NHBE后，可通过上调IL-8、IL-13和IL-25的分泌，促进嗜酸性粒细胞、中性粒细胞参与炎症反应，丙卡特罗可通过下调IL-8和IL-13而非IL-25发挥作用，抑制气道炎症浸润。但本研究仅从细胞因子水平进行探讨，更多体内试验和具体的信号传导通路需要进一步研究探索。
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