胰腺癌是消化系统恶性程度高、预后差的肿瘤之一，绝大多数胰腺癌患者死于肿瘤侵袭转移，侵袭转移不仅是病情恶化的标志，还是治疗失败的重要原因。近年研究发现，上皮-间质转化(EMT)现象在胰腺癌的侵袭转移、化学治疗耐药等恶性发展过程中起着重要的作用[1]。微小RNA(miR)是近年发现的一类内源性非编码小分子RNA。新近研究发现，miR在肿瘤EMT的发生、发展中起重要作用，能进而影响肿瘤EMT所导致的侵袭、转移和耐药性，但尚无胰腺癌EMT与其miR表达谱变化的报道。为此，本研究采用转化生长因子-β1(TGF-β1) 诱导人胰腺癌细胞株BxPC-3建立EMT模型，随后应用miR芯片技术筛选EMT前后的miR差异表达谱，为研究胰腺癌的发生及转移的分子机制提供新思路。
材料与方法 一、材料重组TGF-β1购自美国Propertech公司；高糖DMEM培养基、胰酶-乙二胺四乙酸(EDTA)消化液购自美国Gibco公司；胎牛血清购自杭州四季清生物公司；Transwell小室购自美国Coming公司；Matrigel生物胶购自美国BD公司；鼠抗人上皮钙黏素(E-cadherin)单克隆抗体、鼠抗人神经钙黏素(N-cadherin)单克隆抗体、鼠抗人波形蛋白(Vimentin)单克隆抗体及内参磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)购自南京凯基公司；逆转录及荧光实时定量PCR试剂盒购自瑞士Roche公司。
二、方法 1. 细胞株的培养人胰腺癌细胞株BxPC-3购自上海中科院细胞研究所，用含10%胎牛血清的DMEM培养液于37℃，5%CO2培养箱中培养，细胞均呈贴壁生长。每2~3 d用0.25%胰酶消化传代1次。
2. 细胞形态学的观察分别设立TGF-β1诱导96 h组(TGF-β1处理组)与未经诱导组(对照组)，TGF-β1处理组使用10 ng/ml的重组TGF-β1处理BxPC-3细胞，对照组不予任何处理，2组均培养96 h，于倒置显微镜下观察细胞的形态学变化。
3. 肿瘤细胞侵袭性的检测采用Transwell-Matrigel体外侵袭试验。将Matrigel胶与无血清培养液按1:3比例稀释，取50 μl铺于Transwell上室中，用无血清培养液重悬BxPC-3细胞并种入Transwell上室中(每室100 μl，含1×104个细胞)，TGF-β1处理组与对照组的下室中均加入完全培养基，试验组在此基础上加入终浓度为10 ng/ml的TGF-β1，于37℃培养箱中培养96 h后，取出Transwell小室，用棉棒擦净聚碳酸滤膜上的Matrigel胶，得到小室下面的聚碳酸滤膜，将聚碳酸滤膜以戊二醛固定，行苏木素-伊红(HE)染色。在显微镜中计数，任取5个视野(400倍)，计算每1 mm2内的细胞数，取其平均值，以该平均值作为评价肿瘤细胞侵袭性的指标。
4. EMT标志物的蛋白表达水平检测应用蛋白免疫印迹法检测。收集各组细胞，加入600 μl RIPA细胞裂解液，置冰上30 min后，离心30 min，上清即为总的细胞蛋白溶解成分。上清液加等量2倍载样缓冲液在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶上电泳，然后电转膜到醋酸纤维膜上，用50 g/L脱脂奶粉封闭，分别加入相应一抗(E-cadherin、N-cadherin、Vimentin抗体，终质量浓度均为1:100)，4℃孵育过夜，Tris-HCl缓冲盐溶液洗膜3次，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗(1:10 000)37℃孵育2 h，常规洗膜3次，增强化学发光(ECL)荧光显色系统检测，X线片感光显影，AlphaImager 2200图像系统分析灰度值。
5. EMT标志物的基因表达水平检测按Trizol说明书提取BxPC-3细胞株的总RNA，取2 μl RNA经PCR试剂盒逆转录成模板DNA后行PCR反应。依据试剂盒说明书，配制25 μl反应体系，进行实时定量PCR。E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、GAPDH等基因引物序列由美国Invitrigen公司设计并合成，具体序列见表 1。反应条件为：95℃ 10 min，95℃ 15 s、60℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s；共40个循环。Ct值设定为每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数，实时测定每个反应管内的荧光数值，以2-△△Ct法分析基因的mRNA表达水平，以GAPDH为内参照物，以各基因与GAPDH的比值表示其相对表达水平。
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表 1 CR引物序列表 |
采用紫外吸收测定法测定总RNA浓度和纯度。使用RNA溶液在波长260 nm与280 nm处的吸光度比值(A260/A280)检测RNA纯度，比值在1.8~2.1表明符合要求。变性琼脂糖凝胶电泳测定完整性：制胶，准备RNA样品，取3 μg RNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB核酸染液于甲醛上样染液中至终浓度为10 μg/ml。加热至70℃孵育15 min使样品变性，上样于胶孔中，60 V电压下电泳10 min，紫外透射光下观察并拍照。
7. BxPC-3细胞miR表达谱检测及其数据分析采用博奥生物公司生产的Affymetrix Gene Chip® miR Array微阵列芯片，探针数据库为Sanger miR数据库，试验参照该公司的试验手册操作。采用Trizol试剂盒提取BxPC-3细胞的总RNA。取50~100 g总RNA，用聚乙二醇法分离miR。利用小牛肠碱性磷酸酶进行miR的去磷酸化，然后利用T4 RNA连接酶标记方法进行后续的荧光标记。另外，将RNA溶于16 μl杂交液中，杂交炉中42℃过夜，使用特异性荧光标志物Cy3和Cy5检测杂交，miR微阵列芯片扫描，采用Lux Scan 3.0图像分析软件分析芯片图像，所得数据用于miR差异表达谱的分析。
三、统计学处理应用SPSS 17.0分析试验结果。计量数据以x±s表示，2样本的均数比较采用t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
结果 一、BxPC-3经TGF-β1诱导EMT后的形态学变化BxPC-3细胞形态多呈卵圆形、长椭圆形的上皮样细胞形态，无伪足形成，其相互间排列紧密，形态规则，多呈铺路石样规则排列，见图 1A。经10 ng/ml的TGF-β1刺激96 h后，其细胞形态与对照组相比逐渐由原来的圆形片团状生长变化为长梭形，并且表现出细胞间紧密排列松散、组织间极性下降的倾向。与对照组BxPC-3细胞整片或整块地移动相比，经TGF-β1诱导后的试验组BxPC-3细胞移动更有活力，能单个活动，离开原来的位置，出现EMT的特征性形态学改变，见图 1B。
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图 1 BxPC-3细胞形态学变化(×200) A：未经诱导的BxPC-3；B：经TGF-β1诱导96 h的BxPC-3 |
经TGF-β1刺激96 h后，试验组聚碳酸滤膜上的BxPC-3细胞数为(103.9±4.1)/mm2，对照组聚碳酸滤膜上的BxPC-3细胞数为(80.5±3.6)/mm2，2组聚碳酸滤膜上的BxPC-3细胞数比较差异有统计学意义(t=5.065，P < 0.05)，提示BxPC-3经TGF-β1后刺激后更具有侵袭性，符合BxPC-3经诱导EMT后侵袭性增强的特点，见图 2。
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图 2 聚碳酸滤膜上的BxPC-3细胞HE染色结果(×400) A：未经诱导的BxPC-3；B：经TGF-β1诱导96 h的BxPC-3 |
经TGF-β1刺激96 h后，BxPC-3细胞中上皮标记物E-cadherin的蛋白及mRNA表达水平均低于对照组(t分别为4.031、5.002，P均 < 0.05)，而其间质标记物Vimentin、N-cadherin的蛋白表达水平均高于对照组(t分别为6.802、4.918，P均 < 0.05)，Vimentin、N-cadherin的mRNA表达水平亦高于对照组(t分别为3.852、3.638，P均 < 0.05)，见图 3。
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图 3 BxPC-3细胞中EMT相关因子的蛋白及基因表达情况 A：蛋白免疫印迹法结果；B：PCR定量结果，*P < 0.05 |
RNA的浓度及纯度均符合试验要求，见表 2。变性琼脂糖凝胶电泳试验提示，在紫外透射光下可观察到3条带：最上面的条带为28 S核糖体RNA，第二条带为18 S核糖体RNA，再往下可见到一条较淡稍微扩散的带，由小分子量RNA构成(5S核糖体RNA和tRNA)，提示所提取的RNA完整性符合试验要求的，见图 4。
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表 2 BxPC-3细胞的RNA质量 |
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图 4 BxPC-3细胞RNA完整性 |
Affymetrix Gene Chip® miR Array芯片中包含多个物种的miR信息。排除非人类的miR后，该数据库中共有847个人类miR，将此芯片未检测到表达(即没有荧光信号或信号极弱)、可能为杂讯干扰的分子排除，得出该芯片能够检测出的miR分子216个。筛查结果显示，经诱导EMT后，BxPC-3细胞与对照组比较共26个miR表达水平差异≥2倍，其中15个miR表达上调、11个miR表达下调，见表 3。
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表 3 BxPC-3细胞中差异表达的miR |
胰腺癌由于其侵袭性强，早期往往已经浸润大血管、神经等，造成手术切除难度大，总体5年生存率不足1%[2]。肿瘤早期的浸润及转移是造成胰腺癌患者生存率低下的主要原因。近年来发现，EMT在胰腺癌的侵袭、转移、耐药等过程中起着重要的作用[3-5]。EMT是一种基本的生理病理现象，参与胚胎的形成发育和肿瘤的侵袭转移，以间质表型的获得和上皮表型的缺失为主要特征[6]。TGF-β1在肿瘤发生、发展及纤维化过程中被证实为EMT的主要诱导剂[7]。
本研究中，未经TGF-β1处理的BxPC-3细胞呈典型的上皮细胞形态，经TGF-β1处理后，细胞由原来的圆形片团状生长变化为长梭形，并且表现出细胞间连接减弱，分离, 组织间极性下降的倾向，表现出间质细胞形态特征。随后的Transwell-Matrigel侵袭试验结果显示，经TGF-β1处理后的BxPC-3细胞更加具有侵袭性，符合BxPC-3经诱导EMT后侵袭性增强的特点。判断EMT是否发生，除细胞形态学发生变化外，更重要的1项指标是其相关标志物的表达发生变化。上皮标记物E-cadherin是一种跨膜蛋白，其在维持上皮结构整体性及极性等方面起着重要作用，其丢失会使相邻细胞分离和上皮细胞极性消失，导致相邻细胞间连接变疏松，E-cadherin的表达降低或丢失是EMT最重要的标志性变化[8]。N-cadherin、Vimentin均是间质细胞来源的骨架蛋白，在上皮细胞一般不表达或表达非常低下。这类蛋白增多导致细胞骨架蛋白构成发生变化，使得上皮源性细胞具有成纤维细胞特征，更易于迁移及黏附[9]。因此，上皮标记物E-cadherin表达降低，Vimentin、N-cadherin等间质标记物表达增高被认为是EMT发生的重要标志。本研究采用蛋白免疫印迹法及实时定量PCR检测EMT相关标记物蛋白及mRNA表达变化，结果显示经TGF-β1处理的BxPC-3细胞上皮型标记物E-cadherin表达下调，间质型标记物Vimentin、N-cadherin表达上调，验证了BxPC-3细胞EMT模型的成功建立。
miR与肿瘤EMT的关系已成为近年的研究热点。肿瘤细胞发生EMT的直接后果包括细胞黏附能力下降、穿破基底膜进入血液循环、逃避免疫监视及在远隔部位生长等。研究发现，miR可以在基因转录层面上对EMT及其发展过程中多个环节产生调控作用，进而通过EMT调节肿瘤侵袭转移，因此miR在肿瘤EMT发生、发展中起重要作用[10]。目前尚无胰腺癌EMT与其miR表达谱变化的报道。本研究在诱导人胰腺癌BxPC-3细胞EMT后，采用miR芯片技术对其miR表达谱进行筛选，发现BxPC-3细胞EMT前后miR表达有所变化，26个miR表达差异≥2倍，其中15个miR表达上调、11个miR表达下调。在26个表达差异的miR中，miR-200家族有研究报道可通过EMT调节乳腺癌细胞侵袭转移，miR-155表达缺失可抑制TGF-β1诱导的EMT, 降低细胞的侵袭转移能力[11-12]。其余的24个miR几乎尚未在其他恶性肿瘤中被报道过。
在下一步的研究中，我们将在胰腺癌细胞EMT模型上采用实时定量PCR检测经miR芯片技术分析得出的26个差异表达的miR，筛选出表达趋势符合芯片检测的miR分子，并通过生物信息网络平台预测其作用靶点。
综上所述，本研究通过细胞形态学和分子标记物的变化，验证了人胰腺癌BxPC-3细胞EMT模型的建立，以miR芯片技术为研究手段，对BxPC-3细胞的miR表达谱进行筛选，发现一系列与胰腺癌EMT相关的miR，为进一步研究胰腺癌EMT相关miR的功能提供依据。
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