肝细胞癌的致病因素较多，发病率和病死率均在恶性肿瘤中排名靠前[1]。近年来，肝细胞癌的诊断和治疗有了很大发展，但总体上肝细胞癌的预后仍不理想，5年生存率不足15%。针对肝细胞癌发生、发展的机制，寻找相关的基因作为肝细胞癌筛查的生物标记物或者治疗的靶点是临床研究热点。长链非编码RNA(LncRNA)是长度大于200个核苷酸的非编码RNA[2]。在多个生物学阶段，如表观遗传、转录调控、转录后修饰以及细胞间信号传导中发挥了重要作用[3]。LncRNA与各种疾病的发生、发展亦有着密切联系[4]。LncRNA与肝细胞癌的关系是目前广泛关注的研究热点，例如肝细胞癌高表达基因是首先发现在肝细胞癌中表达上升的LncRNA[5]。HBV X蛋白可以明显提高HULC的表达，从而下调抑癌基因p18的表达来促进HCC细胞的增殖[6]。LncRNA对肝细胞癌发生、发展作用的研究才刚起步，为此本研究筛选在肝细胞癌组织中差异表达的LncRNA，研究其表达水平与肝细胞癌临床病理特征的相关性，现报告如下。
材料与方法 一、标本来源肝细胞癌组织及与其配对的正常肝组织标本来源于2013年3月至2015年8月在中山大学附属第三医院肝脏外科一区行肝脏切除术的患者。入组标准为：① 术前临床诊断为肝细胞癌并进行肝脏切除术；② 肝脏切除术前未进行经导管动脉化学栓塞(TACE)、射频消融或者靶向治疗等处理；③ 术后病理证实为肝细胞癌；④ 患者签署知情同意书。最终从91对标本中筛选出符合条件的40对标本进行后续研究。40例患者中，男35例、女5例，年龄 < 50岁18例、≥50岁22例，合并肝炎35例、肝硬化28例，低分化11例、中分化16例、高分化13例，肿瘤平均直径 < 5 cm 26例、≥5 cm 14例，单发30例、多发10例，病灶侵犯血管12例。
二、试验材料 1. 主要仪器包括：SORVALL RT1台式离心机(Thermo Scientific，美国)，PCR仪(Roche，美国)，实时定量PCR仪(Roche，美国)，UV-1206紫外分光光度计(Shimodzu，日本)。
2. 主要试剂包括：pH 7.4磷酸盐缓冲液(PBS，Gibco，美国)，Trizol RNA抽提试剂(Life Technologies，美国)，RNA保护液(OMEGA，美国)，SYBR® Green PCR预混液(Roche，美国)，去除基因组污染实时逆转录试剂盒(Takara，日本)，焦碳酸二乙酯(DEPC)水(Sigma，美国)，含EB的RNA载样缓冲液(Takara，日本)。
三、方法 1. 肝细胞癌及配对正常肝组织标本的收集在肝脏肿物切除后10 min内，在无菌的条件下取约2 cm×2 cm× 2 cm大小的肝细胞癌组织数块，在距肿物2 cm以外取正常配对肝组织，标本立即使用RNA保护液浸泡于冻存管中，放入液氮罐中长期保存备用。
2. 组织RNA的提取使用Trizol法提取组织标本RNA，按试剂盒说明书步骤操作，提取后使用紫外分光光度计测定RNA浓度，并鉴定纯度。RNA提取成功后使用琼脂糖凝胶电泳进行完整度鉴定
3. LncRNA芯片杂交分析从上述肝细胞癌患者中随机挑选3例，取肝细胞癌组织及其配对正常肝组织标本，分离提纯RNA后，交由上海康成公司行LncRNA基因芯片杂交分析。
4. 基因表达水平的检测将RNA按试剂盒说明书步骤逆转录为模板DNA，然后进行实时PCR扩增，具体反应体系如下：SYBR® Green PCR预混液10 μl、正向引物1.0 μl、反向引物1.0 μl、模板DNA 1.0 μl、无酶水8.0 μl，总体积20 μl。反应条件如下：94℃ 2 min，94℃ 20 s、58℃ 20 s共40个循环，72℃ 20 s。融解曲线分析：温度62~95℃。每份样本重复3次。2-ΔΔCt法计算荧光强度阈值(Ct值)，以GAPDH作为内参，计算样品基因相对表达量。
5. Linc00152的相对表达量与临床病理特征间的关系分析将40例肝细胞癌组织按Linc00152的相对表达量从低至高排序，前20例纳入低表达组、后20例纳入高表达组，分析不同临床病理特征者的Linc00152表达情况。
四、统计学处理使用SPSS 13.0进行统计分析。Linc00152的表达情况以x±s表示，肝细胞癌组织与正常肝组织比较采用配对t检验。使用Graphpad Prism 5绘制柱状图。肝细胞癌临床病理资料用百分率表示，组间比较采用χ2检验。总体比较P < 0.05为差异有统计学意义，多重比较采用Bonferroni法校正检验水准。
结果 一、组织样本RNA的完整性鉴定在凝胶成像系统中观察，大部分被测样本均能呈现明确的28 S和18 S条带，说明提取到的RNA具有良好的完整性，见图 1。选择紫外分光光度计OD260/280为1.8~2.0的RNA样本进行后续试验。
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图 1 组织样本的RNA凝胶电泳图 |
使用基因芯片结合Ensembl等权威据库，取得33 045个LncRNA的差异表达谱(数据已上传至GEO数据库，编号：GSE64633)。以P值 < 0.05、差异表达倍数>2.0或 < 0.5为标准筛选出75个候选LncRNA。使用30对组织标本进行预试验，对AC007009.1、Linc00152、LOC149086、CCAT2等候选LncRNA进行检测，比较其在肝细胞癌组织和配对正常肝组织中的表达情况，排除CCAT2(P=0.1175)，LOC149086(P=0.5526) 等表达差异无统计学意义的LncRNA，选择表达差异有统计学意义的Linc00152为研究对象(P < 0.05)。然后利用数据库找到Linc00152的全长序列，Linc00152位于2号染色体，长度483 bp。
三、Linc00152在肝细胞癌组织中的表达情况40对肝细胞癌组织和配对正常肝组织中，85%(34/40) 的样本Linc00152在肝细胞癌组织中较配对正常肝组织表达上调，见图 2。
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图 2 Linc00152在肝细胞癌组织与正常肝组织中的表达情况 |
肝细胞癌低分化者的Linc00152低表达者比例高于中分化者(P < 0.017)，有血管侵犯者的Linc00152低表达者比例高于无血管侵犯者(P < 0.05)，见表 1。
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表 1 不同临床病理特征者的Linc00152表达情况比较 |
肝细胞癌是一种高病死率的原发性肝癌。血液中甲胎蛋白作为常用的肝细胞癌筛查手段，其特异度和灵敏度不能令人满意，即使其异质体甲胎蛋白-L3也无法取得良好效果[11]。而循环核苷酸作为肿瘤标志物进行筛查具有廉价、便捷和无创的优点，使用LncRNA作为肿瘤标志物的研究正在开展中。例如，通过采集患者尿液中的LncRNA-PCA3进行前列腺癌的筛查，比目前常规筛查所使用的PSA3具有更高的灵敏度和特异度[12]。血浆LncRNA-INSTP1的表达水平检测，可作为甲胎蛋白的补充，提高对肝细胞癌筛查的特异度和灵敏度[13]。
Linc00152与胃癌、肺癌和直肠癌等的相关性及可能的作用机制，已经有了相关报道。Linc00152在胃癌组织中高表达，与胃癌病理分级等临床特征相关，通过与果蝇zeste基因增强子的人类同源物2(EZH2) 结合抑制p15和p21促进胃癌细胞系的生长，推测其可能促进胃癌的发展[7-8]。在肺腺癌中，Linc00152与EZH2相互作用可以抑制IL-24的表达促进肺腺癌的发展[9]。针对直肠癌的研究则显示，miR-376c-3p可以抑制Linc00152的表达，使结直肠癌细胞活力下降，凋亡增加[10]。上述研究提示，Linc00152对多种恶性肿瘤具有促进作用。而且，血浆中的Linc00152是胃癌的独立风险因子，是胃癌筛查的潜在生物标志物[14]。本研究显示，Linc00152在肝细胞癌组织中相对表达量高于正常肝组织，其低表达倾向出现在低分化和有血管侵犯的患者中，提示Linc00152可能与肝细胞癌的预后有关。由于所收集标本的随访时间未超过3年，故未作相关的生存分析，笔者将在时间足够后进行分析。目前笔者正在进行细胞功能试验探索Linc00152对肝细胞癌的作用，并将进行后续报道。
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