动脉粥样硬化是一种慢性动脉疾病，是冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)、脑血管病和血栓栓塞性疾病等缺血性心脑血管病的主要病理基础。动脉粥样硬化发病机制较为复杂，目前尚未完全清楚。近年来越来越多的研究提示动脉粥样硬化实质上为血管受损后发生的一种炎症过程^[1]。因此，使用具有抗炎活性的药物可能成为治疗动脉粥样硬化的新方法。

槲皮素是一种天然的黄酮类化合物，存在于多种植物的花、叶、果实中，具有抗病毒、抗肿瘤、降血糖、降血压等多种作用^[2-3]。近期有研究显示槲皮素能抑制牙龈上皮细胞内多种细胞炎症因子的表达，初步证实槲皮素具有一定的抗炎、抗氧化应激的作用，但槲皮素能否抑制炎症状态下内皮细胞相关炎症因子的表达目前尚不清楚^[4]。在本研究中，笔者采用人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)为研究对象，初步探讨了槲皮素对TNF-α诱导下HUVEC分泌的细胞炎症因子的影响，为槲皮素治疗动脉粥样硬化提供理论基础及依据。

HUVEC购自上海艾研科技有限公司。槲皮素、DMEM低糖培养基、胰蛋白酶购自Sigma公司；胎牛血清购自美国Hyclone公司。细胞核蛋白提取试剂盒购自南京Bioworld生物公司。核转录因子-κB p65(NF-κB p65) 抗体及辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG购自Santa Cruz公司。MTT试剂盒购自碧云天生物技术公司、TNF-α购自武汉博士德生物公司。IL-6、细胞间黏附分子-1(ICAM-1) ELISA检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。PMI1640 3K15低温离心机购自美国Sigma公司。TDL-50B低速台式离心机购自上海安亭科学仪器厂。细胞培养瓶、离心管(15 ml)、12孔培养板均购自美国Corning公司。

在DMEM培养基(含10%胎牛血清)，37℃、5%二氧化碳培养箱中培养HUVEC，将其分为空白对照组(Control组)、TNF-α组(含10 ng/ml TNF-α)，和不同浓度的槲皮素组，各槲皮素组由不同浓度的槲皮素(10 μmol/L、20 μmol/L、50 μmol/L)预处理2 h，然后加入TNF-α(浓度同上)和不同浓度的槲皮素(浓度同上)共孵育24 h，各分组分别简称Q10组、Q20组及Q50组。

采用MTT法检测细胞活力：实验结束前4 h每孔加入20 μl MTT，检测时弃去上清液，加入100 μl二甲基亚砜，轻轻振荡10 min后，用酶标仪在570 nm波长下测定吸光度值，检测HUVEC活力。

各组培养48 h后收集细胞培养上清液。从冰箱取出试剂盒，室温复温平衡30 min。配置标准品、加标准品和待测样本，37℃恒温箱温育30 min。弃去液体，用洗涤液洗板5次。加入酶标试剂50 μl(ICAM-1试剂盒)或100 μl(IL-6试剂盒)，于37℃恒温箱温育30 min(ICAM-1试剂盒)或60 min(IL-6试剂盒)。洗板5次。依序每孔先后加入A、B显色剂各50 μl，于37℃避光显色15 min。每孔加终止液50 μl终止反应。用450 nm波长测量各孔的吸光度值。根据标准品的浓度及对应的吸光度值明确具体含量，ICAM-1蛋白含量采用ng/ml表示、IL-6蛋白含量采用pg/ml表示。各组实验重复3次。

分别提取各组HUVEC核中NF-κB p65蛋白，据BCA试剂盒说明书操作，采用蛋白免疫印迹法检测NF-κB p65蛋白含量。常规电泳、转膜、封闭后加入NF-κB p65和β-actin抗体，于4 ℃轻摇过夜，洗膜，加入二抗于室温孵育1 h，用TBST清洗后，用Odyssey凝胶成像系统扫描成像，用Image J图象分析系统进行灰度分析，以目的产物与β-actin灰度值的比值反映NF-κB p65表达水平。各组实验重复3次。

采用SPSS 16.0分析数据。计量资料用x±s表示。各组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用SNK法，P＜0.05为差异有计学意义。

Control组、TNF-α组、Q10组、Q20组及Q50组的细胞活力分别为0.819±0.046、0.793±0.038、0.815±0.056、0.788±0.072及0.818±0.065，TNF-α组及不同浓度的槲皮素组细胞活力与Control组比较差异无统计学意义(F=0.212，P＞0.05)，表明槲皮素对HUVEC活力没有影响。

培养24 h，各组间ICAM-1、IL-6蛋白含量比较差异有统计学意义，F分别为26.488、185.242，P均＜0.001。其中，与Control组比较，TNF-α组ICAM-1、IL-6蛋白含量均较高(P均＜0.01)；与TNF-α组相比，不同浓度的槲皮素组ICAM-1、IL-6蛋白含量均下降(P均＜0.05)，且随着槲皮素浓度的增加，其对ICAM-1、IL-6蛋白表达的抑制作用更强，具有一定的浓度依赖性，见表 1。

表 1

表 1 槲皮素对TNF-α诱导HUVEC分泌的ICAM-1、IL-6蛋白含量的影响(x±s) 组别 ICAM-1(ng/ml) IL-6(pg/ml) Control组 1.20±0.13 29.74±1.23 TNF-α组 2.87±0.36a 84.56±2.56a Q10组 2.43±0.21b 73.24±3.57c Q20组 1.79±0.14cd 51.97±2.34cd Q50组 1.37±0.27cd 35.74±4.33cde     与Control组比较，a为P＜0.01；与TNF-α组比较，b为P＜0.05，c为P＜0.01；与Q10组比较，d为P＜0.01；与Q20组比较，e为P＜0.01；n=3

表 1 槲皮素对TNF-α诱导HUVEC分泌的ICAM-1、IL-6蛋白含量的影响(x±s)

培养24 h，各组NF-κB p65蛋白表达水平比较差异有统计学意义，F=324.823, P＜0.001。TNF-α组NF-κB p65蛋白表达水平较Control组高(P＜0.01)。与TNF-α组相比，不同浓度的槲皮素组NF-κB p65蛋白的表达均受抑制(P均＜0.05)，且随着槲皮素浓度的增加，其对NF-κB p65蛋白的表达的抑制作用更强，具有一定的浓度依赖性，见图 1。

图 1

图 1 槲皮素对TNF-α诱导HUVEC内NF-κB p65表达的影响 与Control组比较，*为P＜0.01；与TNF-α组比较，#为P＜0.05，Δ为P＜0.01；与Q10组比较，& 为P＜0.01

动脉粥样硬化实质上为血管受损后发生的一种炎症过程。一些炎症相关因子如选择素、白细胞整合黏附分子、促炎症细胞因子等在动脉粥样硬化发生中发挥了关键作用。在动脉粥样硬化的发生过程中，这些细胞因子迅速、大量地表达，参与了白细胞在血管内皮损伤处的迁移和黏附，并促使动脉粥样硬化不断加重^[5]。有研究表明某些药物通过作用于此类因子可发挥抗动脉粥样硬化作用，提示此类因子有作为动脉粥样硬化治疗靶点的可能，为临床上治疗动脉粥样硬化提供新的研究方向^[6]。

ICAM-1属白细胞整合黏附分子中免疫球蛋白超家族成员，主要分布在白细胞、内皮细胞、平滑肌细胞等多种细胞上，可促进动脉粥样硬化病变部位的白细胞与血管平滑肌细胞黏附及滞留，促使动脉粥样硬化形成^[7]。IL-6是介导炎症反应和免疫调节的促炎细胞因子，可促进血管平滑肌增殖，促进内皮细胞黏附分子的表达，还可以增加内皮细胞的通透性，加快动脉粥样硬化进程^[8]。槲皮素能否降低TNF-α诱导的内皮细胞ICAM-1和IL-6的表达，从而对内皮细胞起保护作用，笔者见相关报道较少。本研究结果显示，在TNF-α诱导内皮细胞之前给予槲皮素预处理，可明显降低内皮细胞ICAM-1和IL-6蛋白的表达，提示槲皮素有可能通过减轻动脉粥样硬化中的炎症反应，延缓动脉粥样硬化过程。

NF-κB是炎症过程中的关键调控因子，对多种细胞因子如肿瘤坏死因子等起调节作用，可直接调控细胞因子IL-6、ICAM-1的表达，增强其对单核细胞的趋化、黏附作用，促进动脉粥样硬化的发生^[9]。本研究结果显示，TNF-α可明显诱导内皮细胞NF-κB p65的活化，而槲皮素则可明显抑制TNF-α诱导下内皮细胞NF-κB p65的活化，且抑制作用与槲皮素的浓度呈依赖性，这一结果表明槲皮素有可能通过调节NF-κB p65信号通路来改善血管内皮细胞功能。同时也提示槲皮素可能通过抑制NF-κB p65的活化来减少ICAM-1和IL-6的表达，但其确切机制尚不明确，需行进一步的实验研究。

综上所述，槲皮素可能通过NF-κB p65炎症信号传导通路对血管的炎症反应发挥抑制效应，延缓动脉粥样硬化的发生，本研究为证实槲皮素的抗炎作用提供了新的实验依据。