脑胶质瘤是最常见的颅内恶性肿瘤，其中以胶质母细胞瘤(GBM)最为常见，约占胶质瘤的50%[1-4]。由于GBM具有较强的侵袭性，极易对周围组织造成损伤，传统的治疗手段难以有效杀死全部肿瘤细胞，当前GBM具有较高的致死率和复发率，即使是经历最大范围的手术安全切除了肿瘤，且术后采用经典的STUPP方案行替莫唑胺同步放射及化学治疗后的GBM患者，其中位生存期也仅为14.6个月，而5年生存率则仅为9.8%[5-7]。近年来，随着分子生物学技术的研究进展，GBM的治疗逐渐迈入分子靶向治疗阶段[8-9]。核糖体蛋白(RP)L23定位于核仁，其mRNA包含5个外显子，位于人类17号常染色体，分子量为15 kD。有研究报道，RPL23在多种肿瘤中异常表达[11]。另有研究报道RPL23的高表达能够抑制胃癌细胞的增殖，并有望成为胃癌靶向治疗的分子靶点[12]。然而笔者见目前尚无研究报道RPL23对GBM细胞作用机制，因此分析了GBM基因表达数据集，探讨RPL23在GBM中的临床意义。
对象与方法 一、研究对象在基因表达综合数据库(GEO)下载GBM患者基因表达数据集GSE42669、GSE7696以及GSE4290[13-16]。各基因表达数据集的情况如下，GSE42669：采用Affymetrix公司的HuGene-1_0-st基因表达芯片对58例GBM患者的临床样本进行基因表达谱检测，该数据集提供了55例GBM患者生存的信息[13]。GSE7696：采用了HG-U133_Plus_2基因表达芯片对80例GBM患者及4例正常对照者的脑组织(医学伦理审查资料由原作者提供，下同)进行基因表达谱检测，该数据集提供了80例GBM患者的生存信息[14-15]。GSE4290：采用了Affymetrix公司的HG-U133_Plus_2基因芯片，并采用“Affy”程序包进行预处理，得到GBM和正常脑组织中HG-U133_Plus_2探针集中所有基因的相对表达值水平，该数据集提供了77份GBM样本和23份正常脑组织的基因表达谱数据[16]。
二、方法使用上述3个基因表达数据集分析RPL23在GBM和正常脑组织中的表达情况，探讨RPL23基因表达与GBM临床预后的相关性，同时研究其可能的作用机制。具体步骤如下，首先分析RPL23(探针号：200888_s_at)在GSE4290中的GBM临床样本和正常脑组织中的表达情况。以RPL23(探针号：8014749) 在GSE42669所有样本中表达水平的中位数将该数据集中的GBM样本分为RPL23高表达组和RPL23低表达组，分析2组患者无进展生存期及总生存期的差异。同样的根据RPL23在GSE7696中表达水平的中位数，将该数据集中的GBM样本分为RPL23高表达组与RPL23低表达组，以基因探针富集分析(GSEA)官网的MsigDB数据库中下载的hallmark基因集作为参考基因集，置换次数为1 000次，以P＜0.05、错误发现率(FDR)＜0.25, 使用GSEA法分析RPL23基因对GBM细胞增殖可能的作用机制。
三、统计学处理采用SPSS 21.0处理统计学数据。计量资料以x±s表示。使用Log-rank法对RPL23高表达和RPL23低表达组GBM患者的无进展生存期和总生存期进行分析，并运用Graphpad 5.0软件绘制相应的生存曲线；使用两独立样本t检验比较RPL23基因在GBM组织和正常脑组织中表达的差异。P＜0.05为差异有统计学意义。
结果 一、GBM和正常脑组织RPL23表达的比较分析GSE4290表明，RPL23基因在GBM中的相对表达值为7 607.0 ±1 699.3，低于正常脑组织中的相对表达值13 380.0±4 014.1(t=6.703，P＜0.001)。
二、RPL23高表达组和RPL23低表达组GBM患者预后的比较分析GSE42669表明，RPL23高表达组无进展生存期优于RPL23低表达组(P＜0.0001)，见图 1A；RPL23高表达组的总生存期优于RPL23低表达组(P=0.0046)，见图 1B。
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图 1 GSE42669中RPL23高表达组和RPL23低表达组GBM患者预后比较 |
GSEA法分析结果示，RPL23低表达组主要富集了p53信号通路、IL6-JAK-STAT3信号通路、IL2-STAT5信号通路、KRAS信号通路、PI3K-AKT-mTOR信号通路、细胞凋亡、WNT/β-catenin信号通路以及NOTCH信号通路，提示RPL23可能通过以上信号通路或生物学过程影响GBM细胞增殖，影响GBM患者临床预后，见表 1。
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表 1 SEA法分析结果 |
如前所述，GBM是中枢神经系统常见的恶性肿瘤之一，GBM患者的临床预后极差。目前亟待开发GBM的靶向治疗及诊断危险分层策略。本研究通过再次挖掘已经公开发表的3个独立GBM基因表达数据集，明确RPL23基因在GBM细胞中明显低于其相应的正常组织，高表达RPL23的GBM患者临床预后(无进展生存期及总生存期)明显优于RPL23低表达患者。基于RPL23低表达的GBM的GSEA结果表明RPL23基因可能通过p53信号通路、IL6-JAK-STAT3信号通路、IL2-STAT5信号通路、KRAS信号通路、PI3K-AKT-mTOR信号通路、细胞凋亡、WNT/β-catenin信号通路以及NOTCH信号通路影响GBM细胞增殖，进而影响GBM患者的临床预后。
事实上，目前已经有多篇报道提示RPL23参与多种肿瘤细胞的增殖。Meng等[17]的动物实验表明，RPL23的表达依赖于mTOR的功能，并介导p53通路相关的肿瘤抑制作用。Zhang等[18]的研究也表明，在胃癌细胞中RPL23通过抑制p53-MDM2相互作用关系而维持p53作用，以发挥诱导细胞周期阻滞和凋亡的抗肿瘤作用。另一方面，Zhang等[19]的研究表明，RPL23协同去折叠蛋白反应(unfolded protein response)参与p53依赖的细胞周期阻滞。我们的研究结果表明，低表达RPL23基因的GBM临床样本主要富集在p53相关信号通路，提示在GBM细胞中，RPL23基因的低表达可能通过调节p53相关信号通路而抑制肿瘤细胞。Wu等[20]的研究表明骨髓增生异常综合征患者的肿瘤细胞RPL23的高表达与其凋亡抑制密切相关，高表达RPL23患者临床预后更差。因此，对于本研究来说，RPL23基因对GBM的具体作用机制，尚有待进一步的分子生物学实验验证。
p53基因已经参与体内多种肿瘤的发生和发展。DNA损伤、遗传毒性、癌基因激活、细胞间联系缺失、低氧以及异常增殖通路等多种癌变诱因均能够诱导p53基因激活[21]。Lee等[22]证明Znf179能够通过p53依赖的细胞周期途径诱导多形性成胶质细胞瘤细胞生长停滞并分化。Quan等[23]的研究表明，抑制p53下游分子PIG3能够促进GBM细胞增殖并预示着患者不良预后。Clark等[24]的研究也表明，在GBM细胞中白藜芦醇靶向p53基因，诱导p53基因的表达与激活，并促进其下游分子的转录，进而发挥白藜芦醇抑制GBM细胞增殖和浸润的作用。由此可见，使用药物靶向激活p53或者下调p53的表达能够分别抑制或促进GBM细胞的增殖，并影响GBM患者的临床预后。我们的研究表明，低表达RPL23的GBM临床样本主要富集p53等多种信号通路或生物学过程，提示RPL23基因可能通过p53相关通路影响GBM细胞的增殖，但是具体的作用机制有待进一步证实。以上分析表明，RPL23可能为GBM患者的独立保护性因素。
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