原发性肝细胞癌是严重威胁人类生命健康的恶性肿瘤之一，尽管近年来该病的基础研究和临床研究均取得了巨大进展，但其防治效果仍不尽如人意，肝细胞癌相关分子机制仍未清楚是重要的原因之一。自噬是细胞在受到刺激后，吞噬体内细胞质或细胞器形成自噬体，自噬体内的内容物在溶酶体作用下降解、再利用的过程，可分为巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬[1]。近年大量研究发现自噬在肿瘤的发生、发展、耐药、转移以及预后等过程中发挥着重要意义，肿瘤细胞可通过自噬抵御炎症和药物损伤，从而不断异常分裂、增殖，甚至产生耐药和逃逸[2-3]。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是一种主要由巨噬细胞和单核细胞产生的促炎细胞因子，具有多种生物活性。真核细胞中内质网腔内因错误折叠或未折叠蛋白聚集，或者钙离子平衡紊乱可引起内质网应激，对于调控肿瘤细胞的生存、凋亡发挥着重要作用。研究已发现TNF-α作为重要的炎症因子，在肝癌细胞的发生和发展中发挥着重要的作用，但其对肝癌细胞内质网应激及自噬的作用报道较少[4-5]。本研究旨在观察TNF-α在肝癌细胞中对内质网应激、自噬及细胞增殖的作用，试图探讨可能存在的作用机制。
材料与方法 一、材料来源收集2014年4月至12月在中山大学附属第三医院进行肝血管瘤或肝细胞癌手术切除标本各10例，正常肝组织取自肝血管瘤患者距离血管瘤边缘2 cm以上的部位组织，肝细胞癌患者配对癌旁组织选取自距离癌灶边缘2 cm以上部位，所有组织标本均经苏木素-伊红染色进行组织学确认。本研究遵循的程序符合中山大学附属第三医院临床医学研究伦理委员会所制定的伦理学标准，得到该委员会批准，征得患者的知情同意并签署知情同意书(中大附三医伦[2014]2-7号)。
二、实验试剂及仪器 1. 主要试剂及抗体DMEM培养液(Gibco, US)、TNF-α重组因子(Pepro Tech, US)、TNF-α抗体(Santa Cruz, US)、PCNA抗体(Santa Cruz, US)、BECN1抗体(Abcam, US)、LC3B抗体(Sigma, US)、β-arrestin1抗体(Abcam, US)、GAPDH抗体(Santa Cruz, US)、eIF2α和p-eIF2α抗体(Cell Signaling Technology, US)、DAB显色液(DAKO, Denmark)；CCK-8试剂盒(Dojindo, Japan)。人肝癌细胞系HepG2由中山大学附属第三医院中心实验室惠赠。
2. 主要仪器显微镜(Leica, Germany)，SDS-PAGE电泳槽(BIO-RAD, US)，转膜仪(BIO-RAD, US)，PCR仪(Labnet, US)，Nanodrop 2000微量紫外分光光度计(Thermo Scientific, US)，低温高速冷冻离心机(Eppendorf公司, Germany)等。
三、实验方法 1. 免疫组织化学染色人体组织标本经甲醛固定、乙醇梯度脱水、二甲苯透明以及浸蜡后制成石蜡切片。石蜡切片经脱蜡和阶梯水化后，置于3%双氧水中10 min去除过氧化物酶，在pH 6.0的柠檬酸钠修复液中高温高压修复2 min，血清封闭10 min，分别滴加一抗：抗-TNF-α(1:100)、抗-BECN1(1:200)、抗-LC3B(1:200)、抗-PCNA(1:200) 4℃孵育过夜；PBST浸泡5 min，二抗37℃孵育2 h，滴加DAB显色，适时清水终止反应，苏木素-伊红染色后树脂封片，显微镜下观察。
2. 细胞培养及处理接种细胞于6孔板中，用含10%胎牛血清的DMEM培养，待细胞密度达80%时，将细胞分为4组。TNF-α处理组：TNF-α(40 ng/ml)处理细胞8 h；3-MA组：3-MA(10 mmol/L)处理细胞8 h；3-MA+ TNF-α处理组：同时用TNF-α(40 ng/ml)和3-MA(10 mmol/L)处理细胞8 h；空白组：加入DMEM。
3. 细胞总蛋白提取以及蛋白电泳在6孔板中加入适量含有蛋白酶抑制剂的裂解液，用细胞刷轻轻刮下细胞，混匀裂解液，冰上作用30 min，BCA法测蛋白浓度，100℃加热变性5 min后，-80℃保存。取适量蛋白进行蛋白电泳，牛奶封闭2 h，分别滴加一抗：抗-BECN1(1:2 000)、抗-LC3B(1:2 000)、抗-PCNA(1:2 000)、抗-eIF2α(1:2 000)、抗-p-eIF2α(1:2 000)，4℃摇床孵育过夜，TBST洗涤15 min，滴加二抗常温孵育2 h，TBST洗涤15 min，暗房压片曝光。胶片条带用Image J图像分析软件进行灰度分析。
4. 细胞活性测定将细胞接种于96孔板，每孔约1 000个细胞(200 μl/孔)，每组设3个复孔，重复实验3次。按照分组对细胞进行处理，一定时间后将培养基吸出，待测孔每孔加入10 μl CCK8溶液和90 μl DMEM培养液。在细胞培养箱继续孵育3 h后，用酶标仪测定在490 nm处的吸光值，记为该孔的细胞增殖活性。
四、统计学处理应用SPSS 20.0软件进行统计学分析。计量资料以x±s表示，2组独立样本间比较采用独立样本t检验，配对样本间比较采用配对t检验，多组独立样本间比较应用单因素方差分析法，进一步两两比较采用LSD-t检验法分析，P＜0.05为差异有统计学意义。
结果 一、人肝癌癌灶组织、癌旁组织和正常肝组织相关蛋白分析对3种人样本组织进行石蜡包埋、切片、免疫组织化学染色，发现TNF-α、自噬相关蛋白BECN1、LC3B主要在组织细胞胞浆中弥漫性表达，PCNA主要在胞核中表达，DAB染色为棕黄色阳性信号。TNF-α在正常肝组织中的阳性信号少于癌旁和癌灶组织，BECN1、LC3B、PCNA蛋白在癌灶组织和癌旁组织中阳性信号明显多于正常肝组织，见图 1。每组组织样品各10例进行免疫组织化学染色随机计数900个细胞，经统计发现，TNF-α在癌灶组织[(20.5±7.8)%]和癌旁组织[(24.3±10.2)%]中的表达高于正常肝组织[(3.4±5.2)%]；同样的，自噬相关蛋白BECN1在癌灶组织[(75.1±8.3)%]和癌旁组织[(74.3±12.5)%]中的表达高于正常肝组织[(20.5±13.8)%]；LC3B在正常肝组织[(20.7±12.1)%]中表达少于癌灶组织[(80.6±9.6)%]和癌旁组织[(83.3±10.4)%]；PCNA在癌灶组织[(16.3±6.3)%]和癌旁组织[(17.8±9.4)%]中表达高于正常肝组织[(5.2±8.1)%]。癌灶组织与正常肝组织比较，tTNF-α=8.62、tBECN1=7.43、tLC3B=6.28、tPCNA=8.81，P均＜0.05；癌旁组织与正常肝组织比较，tTNF-α=6.55、tBECN1=9.31、tLC3B=8.56、tPCNA=8.34，P均＜0.05；癌旁组织与癌灶组织比较，tTNF-α=2.06、tBECN1=1.68、tLC3B=1.97、tPCNA=8.53，PPCNA＜0.05、PTNF-α、PBECN1、PLC3B均>0.05。
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图 1 人肝癌癌灶、癌旁组织和正常肝组织中相关蛋白水平(×200) A、B、C：正常肝组织(Normal)、癌旁组织(Paracancer)、肝癌癌灶组织(HCC)TNF-α免疫组织化学染色；D、E、F：正常肝组织、癌旁组织、肝癌癌灶组织BECN1免疫组织化学染色；G、H、I：正常肝组织、癌旁组织、肝癌癌灶组织LC3B免疫组织化学染色；J、K、L：正常肝组织、癌旁组织、肝癌癌灶组织PCNA免疫组织化学染色 |
利用TNF-α刺激HepG2细胞8 h后提取蛋白，蛋白免疫印迹法分析显示TNF-α刺激组细胞中BECN1、LC3B、PCNA蛋白水平升高。相对TNF-α刺激组而言，TNF-α+3-MA处理组中PCNA蛋白水平并未见明显升高。利用CCK-8试剂盒检测细胞增殖活性，TNF-α刺激组细胞活性较空白对照组明显升高，然而加入自噬抑制剂3-MA后细胞活性升高不明显，见图 2。
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图 2 不同处理条件下HepG2细胞相关蛋白检测及细胞活性实验 A：空白对照组和TNF-α处理组中BECN1、LC3B、PCNA蛋白免疫印迹电泳图；B：空白对照组、TNF-α处理组、3-MA处理组、TNF-α+3-MA处理组中PCNA蛋白水平；C：空白对照组(Vehicle)、TNF-α处理组、3-MA处理组、TNF-α+3-MA处理组细胞活性检测，方差分析结果F值=8.21，与对照组比较，LSD-tTNF-α组=6.38，LSD-t3-MA组=4.12，LSD-tTNF-α+3-MA组=3.56；与TNF-α组比较，LSD-tTNF-α+3-MA组=3.72；与空白对照组比较，*P＜0.05；与TNF-α处理组比较，#P＜0.05 |
研究已显示内质网应激会引起细胞自噬水平升高，而eIF2α蛋白磷酸化水平升高亦提示内质网应激增强。提取细胞蛋白，通过蛋白免疫印迹法和灰度分析检测各分组中p-eIF2α及eIF2α蛋白表达量。实验结果显示，不论是否使用TNF-α因子刺激细胞，细胞中eIF2α蛋白水平并无明显改变。而对于未加TNF-α刺激组，p-eIF2α表达量较低，eIF2α蛋白磷酸化水平低。在TNF-α刺激下，细胞中eIF2α蛋白磷酸化水平明显增强，p-eIF2α蛋白表达量升高，见图 3。
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图 3 HepG2细胞p-eIF2/eIF2蛋白表达情况 A：不同处理条件下HepG2细胞p-eIF2α/eIF2α蛋白免疫印迹电泳图；B：p-eIF2α/eIF2α灰度值分析；与空白对照组(Vehicle)比较，*P＜0.05 |
原发性肝细胞癌的发病率和病死率均较高，其发生、发展的分子机制尚未明确是防治效果差的重要原因之一。大量研究已经证实，在肝细胞癌的发生、发展过程中，炎症反应起到了重要的推动作用，长期持续的慢性炎症刺激会促进肝细胞癌变，其中炎症因子TNF-α发挥着重要作用[6-7]。自噬是维持细胞正常生理代谢的重要信号通路，其作用具有双面性，一方面自噬可以及时清除并再利用细胞内无用的细胞成分、代谢产物而为细胞提供能量，维持细胞的正常功能而存活，但相反过强的自噬反应将引起细胞损伤，导致细胞死亡，故也有人将其称为凋亡与坏死外的第3种细胞“死亡”方式。相关研究显示，肿瘤细胞在不利的细胞外环境刺激下，可以通过自噬去获得维持生存所需的营养物质，从而维持肿瘤细胞的生存、产生耐药性，并促进肿瘤细胞的远处转移[8]。
既往研究已发现炎症和自噬的发生有着密切关系，炎症反应可促进细胞内自噬的发生以拮抗炎症因子对细胞的损伤，促进细胞的损伤修复而维持细胞生存[9-10]。但是，炎症因子TNF-α是否可以通过自噬促进肝癌细胞的增殖却不明确，本研究首先通过对人体肝癌样本进行分析，发现在原发性肝细胞癌组织和癌旁组织中TNF-α、自噬相关蛋白BENC1、LC3B以及增殖标志物PCNA较正常肝组织均有升高，提示自噬在肝细胞癌的发生、发展过程中可能有着重要的意义，且自噬活动可能影响肝癌细胞增殖。为了进一步验证上述观点，我们用TNF-α因子刺激HepG2肝癌细胞株，发现TNF-α因子刺激后，HepG2细胞的自噬水平和增殖活性明显上调，同时，利用自噬抑制剂3-MA抑制HepG2细胞自噬后，和对照组比较发现，TNF-α刺激未引起细胞增殖活性的明显升高，提示TNF-α可能通过诱导肝癌细胞的自噬促进其增殖。
大量研究已证实，内质网应激与自噬有着密切的关系，内质网应激激活并发生未折叠蛋白反应将引起细胞内自噬水平的上调[11-12]。eIF2α作为内质网应激信号通路中的重要信号分子，参与了细胞凋亡、增殖以及炎症调节，其蛋白的磷酸化水平(p-eIF2α)是提示内质网应激通路激活的标志物之一。在本研究中，我们发现使用TNF-α刺激肝癌细胞后，细胞中p-eIF2α蛋白水平明显升高，提示TNF-α诱导的炎症反应激活了HepG2细胞的内质网应激信号通路。
综上所述，TNF-α可能通过激活内质网应激通路诱导肝癌细胞自噬而促进细胞增殖。该研究为肝癌细胞自噬的发生机制提供了新的依据，为通过调节自噬抑制肝癌的发生、发展提供科学依据。
| [1] |
Mizushima NT, Yoshimori T, Levine B. Methods in mammalian autophagy research[J]. Cell, 2010, 140(3): 313-326. DOI:10.1016/j.cell.2010.01.028 |
| [2] |
Bao L, Chandra PK, Moroz K, Zhang X, Thung SN, Wu T, Dash S. Impaired autophagy response in human hepatocellular carcinoma[J]. Exp Mol Pathol, 2014, 96(2): 149-154. DOI:10.1016/j.yexmp.2013.12.002 |
| [3] |
Ogier-Denis E, Codogno P. Autophagy: a barrier or an adaptive response to cancer[J]. Biochim ica Et Biophysica Acta, 2003, 1603(2): 113-28. |
| [4] |
Liedtke C, Trautwein C. The role of TNF and Fas dependent signaling in animal models of inflammatory liver injury and liver cancer[J]. Eur J Cell Biol, 2012, 91(6-7): 582-589. DOI:10.1016/j.ejcb.2011.10.001 |
| [5] |
He C, Lao WF, Hu XT, Xu XM, Xu J, Fang BL. Anti-liver cancer activity of TNF-related apoptosis-inducing ligand gene and its bystander effects[J]. World J Gastroenterol, 2004, 10(5): 654-659. DOI:10.3748/wjg.v10.i5.654 |
| [6] |
Grivennikov SI, Greten FR, Karin M. Immunity, inflammation, and cancer[J]. Cell, 2010, 140(6): 883-899. DOI:10.1016/j.cell.2010.01.025 |
| [7] |
杜宝玲, 张征宇, 马宁芳. Bcl-2和核因子-κB在肝癌组织中的表达及其与临床预后的相关性——附69例分析[J]. 新医学, 2009, 40(11): 737-738. DOI:10.3969/j.issn.0253-9802.2009.11.015 |
| [8] |
Zhang C, Syed TW, Liu R, Yu J. Role of endoplasmic reticulum stress, autophagy, and inflammation in cardiovascular disease[J]. Front Cardiovasc Med, 2017, 4: 29. DOI:10.3389/fcvm.2017.00029 |
| [9] |
Liu Y, Gong W, Yang ZY, Zhou XS, Gong C, Zhang TR, Wei X, Ma D, Ye F, Gao QL. Quercetin induces protective autophagy and apoptosis through ER stress via the p-STAT3/Bcl-2 axis in ovarian cancer[J]. Apoptosis, 2017, 22(4): 544-557. DOI:10.1007/s10495-016-1334-2 |
| [10] |
Zhang HT, Chen GG, Hu BG, Zhang ZY, Yun JP, He ML, Lai PB. Hepatitis B virus x protein induces autophagy via activating death-associated protein kinase[J]. J Viral Hepat, 2014, 21(9): 642-649. DOI:10.1111/jvh.2014.21.issue-9 |
| [11] |
Zheng X, Jin X, Li F, Liu X, Liu Y, Ye F, Li P, Zhao T, Li Q. Inhibiting autophagy with chloroquine enhances the anti-tumor effect of high-LET carbon ions via ER stress-related apoptosis[J]. Med Oncol, 2017, 34(2): 25. DOI:10.1007/s12032-017-0883-8 |
| [12] |
Yin Y, Sun G, Li E, Kiselyov K, Sun D. ER stress and impaired autophagy flux in neuronal degeneration and brain injury[J]. Ageing Res Rev, 2017, 34: 3-14. DOI:10.1016/j.arr.2016.08.008 |