羟基磷灰石(HAP)的主要成分为钙和磷，因其生物相容性作用，常被用作骨修复生物材料[1]。近年研究报道，纳米HAP(nHAP)本身也具有抑制结肠癌、肝癌细胞的作用[2-7]。目前笔者尚未见nHAP对卵巢癌细胞的作用及相关机制研究，为此本研究观察了nHAP对卵巢癌细胞株SKOV3的生长抑制作用，并进一步深入探讨其机制，现报告如下。
材料与方法 一、材料卵巢癌细胞株SKOV3由吉林大学第二医院妇科实验室提供。RPMI 1640培养基、小牛血清、碘化丙啶(PI)、胰酶、MTT选自美国Sigma公司，其余试剂均选自国产分析纯。nHAP长约60~80 nm，半径约5~10 nm。
二、方法 1. 卵巢癌SKOV3细胞的培养适宜条件下于含小牛血清的RPMI 1640培养基中培养卵巢癌SKOV3细胞，隔日换液，按1:3的比例传代。
2. 卵巢癌SKOV3细胞在nHAP中的生长情况检测将nHAP用培养液配成10种梯度浓度(10、20、50、100、150、200、250、300、350、400 mg/L)，选对数期生长的卵巢癌SKOV3细胞进行试验。接种于96孔板，孵箱培养24 h后弃培养液，分别加入调配好的10种梯度浓度nHAP液，对照组为等量卵巢癌SKOV3细胞加等量培养液，每浓度设8复孔，48 h后每孔再加5 g/L的MTT 20 μl，继续培养4 h。吸净液体后每孔加入150 μl二甲亚砜。均匀摇动10 min，酶标仪测OD450值(OD值)。计算nHAP作用下的细胞抑制率，绘制量效曲线，并分别计算出nHAP对卵巢癌SKOV3细胞的30%、50%、70%抑制浓度(IC30、IC50、IC70)。同法接种96孔板，24 h后弃培养液，此时分别加入IC30、IC50和IC70的nHAP，培养24、48、72、96、120、144 h时，MTT法检测细胞抑制情况，试验重复3次，结果取平均值。绘制这3种浓度nHAP下卵巢癌SKOV3细胞生长的时效曲线。细胞存活率(%)=(试验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)×100%；细胞抑制率(%)=1-(试验组OD值－空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)×100%[4]。
3. nHAP作用后卵巢癌SKOV3细胞的形态观察48 h后收集对照组和IC50的nHAP作用下的卵巢癌SKOV3细胞(试验组)，戊二醛固定，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗，1%OsO4再固定，PBS再清洗。脱水后以Epon812树脂包埋3 h，切片、双重染色后用透射电子显微镜观察。
4. 细胞周期分析流式细胞仪检测各组细胞周期的比例，用Sub G1峰法分析各组细胞的凋亡率。
三、统计学处理采用SPSS 19.0处理数据，计量资料以x±s表示，组间比较采用t检验；计数资料以百分率表示。P＜0.05为差异有统计学意义。
结果 一、nHAP作用于卵巢癌SKOV3细胞的量效曲线nHAP作用48 h后，10种不同浓度nHAP对卵巢癌SKOV3细胞均表现抑制作用，见图 1。当nHAP浓度≤100 mg/L时，抑制率随浓度增高而增高。当HAP浓度>100 mg/L后，抑制率增加速度变缓。nHAP对SKOV3的IC30、IC50、IC70分别为9.46、28.83、60.80 mg/L。
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图 1 nHAP作用于卵巢癌SKOV3细胞48 h的量效曲线 |
IC30、IC50、IC70的nHAP作用卵巢癌SKOV3细胞48 h期间，抑制率随时间延长而升高，48 h后抑制率增速变缓，见图 2。
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图 2 IC50 nHAP作用于卵巢癌SKOV3细胞的时效曲线 |
光镜下，对照组卵巢癌SKOV3细胞呈贴壁生长，呈略圆形或多角形，核较大，多为单核，可见较多核分裂相。与对照组相比，经IC50 nHAP作用48 h的试验组SKOV3细胞密度降低，细胞间隙增宽，且形态不规则，核分裂相减少，见图 3。
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图 3 nHAP对卵巢癌SKOV3细胞的形态学影响(光镜，×200) A：对照组; B：试验组(IC50) |
透射电镜下，对照组卵巢癌SKOV3细胞核较大，异形明显，染色质分布较均匀，线粒体无明显异常。经IC50 nHAP作用48 h的试验组SKOV3细胞可见HAP纳米粒子，细胞呈凋亡形态学改变，胞体变小，胞膜完整，核浓缩，胞浆内可见空泡，并伴有线粒体肿胀，见图 4。
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图 4 nHAP对卵巢癌SKOV3细胞的形态学影响(透射电镜，×8 000) A：对照组; B：试验组(IC50) |
选用IC50的nHAP作用卵巢癌SKOV3细胞48 h，与无nHAP的对照组卵巢癌SKOV3细胞对比，试验组G0/G1期百分比高，S期细胞百分比低，2组间比较差异有统计学意义(P均＜0.05)，2组G2/M期细胞百分比比较差异无统计学意义(P>0.05)。试验组凋亡率高于对照组(P＜0.05)，见表 1。
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表 1 IC50的nHAP对卵巢癌SKOV3细胞周期和凋亡率的影响(x±s) |
1992年Hideki等采用液相沉淀法合成纳米羟基磷灰石微晶体，并意外发现HAP微晶体对Ca-9肿瘤细胞的增殖也有明显的抑制作用。在随后的研究中发现HAP纳米粒子对多种肿瘤细胞的生长均有抑制作用[2-7]。
本研究显示，nHAP能抑制卵巢癌SKOV3细胞生长，当nHAP≤100 mg/L时，nHAP对卵巢癌SKOV3细胞的抑制率随浓度增高而增高，而IC30、IC50、IC70的nHAP在48 h内对卵巢癌SKOV3细胞的抑制率随时间延长而升高，表明48 h内为其敏感期。
目前尚未明确nHAP对肿瘤细胞的抑制机制，本研究为了探讨nHAP抑制卵巢癌SKOV3细胞生长的机制，首先对SKOV3细胞进行了形态学观察，发现试验组细胞呈凋亡形态学改变，胞核和胞浆内有大量的nHAP，因此考虑为nHAP体积小，可通过胞膜、核膜引起DNA损伤，导致细胞凋亡。有学者认为，nHAP非特异性的吞噬能力与黏附能力密切相关。纳米级材料具有较大的表面能，与非nHAP相比更容易被肿瘤细胞所吞噬[8-9]。
本研究还通过流式细胞仪定量分析了对照组与试验组的细胞周期所占比例和凋亡率。在细胞周期中，正常情况下细胞一旦进入S期、开始合成DNA，就会不间断地、有顺序地通过细胞的各个周期，完成细胞分裂，直至G1期，因此细胞的增殖通常是由DNA合成开始所控制的。本研究显示，用药组的S期细胞明显少于对照组，而G0/G1期细胞多于对照组，因此我们认为nHAP作用于卵巢癌SKOV3细胞的S期，使其凋亡，不能达到G2期，最终不能完成细胞分裂和增殖。
综上所述，nHAP有抑制卵巢癌细胞株SKOV3生长的作用，其机制可能是nHAP作用于卵巢癌SKOV3细胞的S期，诱导肿瘤细胞凋亡。
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