肝细胞癌是原发性肝癌的主要类型，是最常见的恶性肿瘤之一，在全球消化系统肿瘤中，病死率占第三位^[1-2]。在我国其病死率在消化系统恶性肿瘤中排第二位, 其发病率呈上升趋势, 目前，肿瘤切除及肝脏移植是最有效的治疗手段，射频消融及化学治疗等可改善癌症患者的预后，尽管这些治疗手段可减少患者的病死率，但肝癌患者术后的复发及化学治疗的耐药仍然是需要迫切解决的问题^[3]。研究认为，肝癌的发生和发展与信号通路的紊乱有着紧密的联系，PTPN9作为蛋白质酪氨酸磷酸酶（PTP）非受体家族中的重要成员，负向调控多种生物信号通路，参与了多种病理生理过程，但其在肝癌发生发展中的作用及调控机制尚待阐明^[4-5]。本研究通过免疫组织化学（组化）检测PTPN9在组织中的表达，探讨其与肝癌预后的关系，以期为早期诊断及治疗提供依据。

收集南昌大学第一附属医院手术切除的新鲜原发性肝癌标本，包括肝癌及其距肝癌1 cm的癌旁肝组织标本，本研究中石蜡病理标本129例肝癌标本临床资料从中山大学肿瘤防治中心病理科获得。随访终点为死亡、失访或生存至截止日期，随访期间的失访者算作删失值。自确诊至患者死亡之间的时间定义为总生存时间（OS）。本研究经我院医学伦理委员会批准。

收集蛋白样品后，在10%~12%的凝胶中制备并分离蛋白质样品。转移到PVDF膜(Millipore, Boston, USA)，然后被牛血清白蛋白阻断。在4℃下，抗体PTPN9(Santa Cruz, USA)和β-actin(Santa Cruz, USA)孵育过夜。用TBST对膜进行清洗，在室温下用山羊抗兔二次抗体孵育。最后，对膜进行了曝光。

提取肝脏组织RNA，按说明书(南京凯基公司）成份准备RT反应液（所有液体配制均应在冰上进行）, 合成cDNA，将得到的cDNA溶液作为模板加入到说明书的PCR反应体系中，预变性：95℃ 30 s。PCR反应：（95℃ 5s；60℃ 20 s）×45个循环。

石蜡切片脱蜡置水，3%H₂O₂，室温孵育消除内源性过氧化物酶的活性。蒸馏水冲洗，5%正常山羊血清封闭，室温孵育10 min，滴加一抗4 ℃过夜。滴加生物素标记二抗工作液，显色剂显色3 min，自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。PTPN9蛋白水平检测采用H-score法。阳性细胞的百分率为“0”(0%)、“1”(1%~25%)、“2”(26%~50%)、“3”(51%~75%)、“4”(76%~100%)。强度评分为“0”(阴性染色)、“1”(弱染色)、“2”(中度染色)和“3”(强染色)。两名病理学医师在不了解患者的临床和病理变量的情况下，以双盲方式独立地评价了所有的切片。

采用SPSS 13.0进行统计分析。配对设计的定量资料组间比较采用配对t检验, 组间构成比的比较采用Fisher确切概率法。Kaplan-meier法绘制生存曲线并做对比(Log-rank test)。采用Cox比例风险回归模型来确定预后影响因素。P < 0.05为差异有统计学意义。

为了检测肝癌组织中PTPN9的表达，通过蛋白免疫印迹法和RT-PCR检测8例肝癌标本中PTPN9的蛋白及mRNA的表达，从图 1A可以看出PTPN9蛋白的表达低于癌旁组织；图 1B也显示PTPN9的mRNA表达低于癌旁组织，差异有统计学意义（t=4.833，P < 0.01)。

图 1

图 1 PTPN9在肝癌组织和细胞中的表达情况 A：蛋白免疫印迹法检测PTPN9蛋白在8例肝癌组织(T)及癌旁组织(P)中的表达；B：RT-PCR检测PTPN9 mRNA在8例肝癌组织(T)及癌旁组织(P)中的表达；**P < 0.01

为了进一步研究PTPN9在肝癌组织中的表达，构建了一个由129例肝癌标本组成的组织芯片。免疫组化结果显示，PTPN9是主要分布于胞浆内，见图 2。相比于癌旁组织，PTPN9在肝癌组织中的表达较低（t=3.224，P < 0.01)，见图 3。

图 2

图 2 肝癌组织芯片中129例组织PTPN9的表达情况

图 3

图 3 肝癌组织芯片129例组织中PTPN9的表达情况与癌旁组织比较，**P < 0.01

为了揭示PTPN9在肝癌中的临床意义，PTPN9的表达与临床参数进行相关研究。结果显示PTPN9低表达与肿瘤大小（P=0.049）、TNM分期（P=0.018）和肿瘤的个数（P=0.006）密切相关。而与年龄、性别、HBV感染、AFP、肝硬化及血管侵犯无关系，见表 1。

表 1

表 1 129例肝癌患者PTPN9的表达与临床病理参数的关系 例（%） 项目 PTPN9 低表达 高表达 P值 年龄(岁) 0.725      < 48 67 34(50.7) 33(49.3)     ≥48 62 29(46.8) 33(53.2) 性别 0.357     项目 PTPN9 低表达 高表达 P值     女 11 7(63.6) 4(36.4)     男 118 56(47.5) 62(52.5) HBV 0.157     阳性 115 59(51.3) 56(48.7)     阴性 14 4(28.6) 10(71.4) AFP(ng/ml) 0.200      < 20 47 19(40.4) 28(59.6)     ≥20 82 44(53.7) 38(46.3) 肝硬化 1.000     有 96 47(49.0) 49(51.0)     无 33 16(48.5) 17(51.5) 肿瘤大小(cm) 0.049      < 5 53 20(37.7) 33(62.3)     ≥5 76 43(56.6) 33(43.4) 肿瘤数目 0.006     单个 49 16(32.7) 33(67.3)     多个 80 47(58.8) 33(41.3) TNM分期 0.018     Ⅰ~Ⅱ 49 17(34.7) 32(65.3)     Ⅲ~Ⅳ 80 46(57.5) 34(42.5) 血管侵犯 1.000     有 15 7(46.7) 8(53.3)     无 114 5649.1) 58(50.9)

表 1 129例肝癌患者PTPN9的表达与临床病理参数的关系

PTPN9高表达与PTPN9低表达患者的kaplan meier累积生存曲线显示，PTPN9表达越低，生存时间越短，见图 4，影响肝癌患者预后的多因素分析显示，PTPN9被认为是肝癌患者总体生存率的保护因素（HR= 0.453，95% CI 0.275~0.744，P=0.002），见表 2。

图 4

图 4 PTPN9的表达量与总生存时间的相关性

表 2

表 2 肝癌患者生存预后的多因素分析 因素 多因素分析 HR(95%CI) P值 肿瘤数目(单个vs.多个) 1.832(0.953~2.641) 0.293 肿瘤大小( < 5 vs.≥5 cm) 1.119(0.658~1.905) 0.678 血管侵犯(有vs.无) 1.680(0.854~3.305) 0.133 TNM分期(Ⅰ~Ⅱvs.Ⅲ~Ⅳ) 1.260(0.809~1.982) 0.688 PTPN9表达(低vs.高) 0.453(0.275~0.744) 0.002

表 2 肝癌患者生存预后的多因素分析

近年来，人们越来越多地致力于揭示肝细胞癌发生发展的机制，旨在探索肝癌临床治疗的新策略。

在人类基因组中，PTP家族含有107个成员, PTP在细胞多种功能方面都起着关键的作用，也被认为是新一代的药物靶点^[6-11]。PTP主要通过逆转蛋白质酪氨酸激酶的作用并一起调控蛋白质酪氨酸磷酸化过程，调控细胞的生长、分化、迁移、存活、凋亡，许多研究表明，PTP功能的失调及基因的修饰可导致癌症及自身免疫性疾病的发生^[12-16]。研究证实，PTPN12的低表达与肝癌的复发及预后成正相关，降低肝癌细胞中的PTPN11会增加肝癌细胞对顺铂及

氟尿嘧啶的耐药性，而PTPN9作为PTP非受体家族中的一员，位于染色体15q24.2，含有N末端结构域，可特异性结合磷脂酰丝氨酸调节凋亡细胞的吞噬过程，与底物VEGFR2结合，可负向调控内皮细胞的VEGFR2信号通路^[17-20]。在乳腺癌中研究发现，PTPN9直接作用于底物STAT3和EGFR而抑制其磷酸化，在乳腺癌发生及发展过程中起着重要作用^[21-22]。

研究证实STAT3转录因子参与肝癌的发展，在肝癌组织中STAT3可持续性激活，STAT3的缺失可缓解肝癌的生长，其主要作用机制是调控细胞周期因子的转录，如细胞周期蛋白D1等^[23-24]。而PTPN9作为调控STAT3的重要基因，其在肝癌中的作用仍然不清楚，在本研究中，我们发现PTPN9在肝癌表达中明显下调, 有研究证实，多个miRNA可调控PTPN9的表达，但其在肝癌中下调的机制有待于进一步研究^[25]。我们进一步通过免疫组化技术对肝癌组织芯片中129例组织PTPN9的表达情况进行分析，并结合临床数据分析显示肝脏组织中PTPN9的表达量是肝癌的预后的影响因素，PTPN9的表达越低，患者预后越差。这可能表明PTPN9在肝癌发生发展中起到重要作用。因此，继续深入研究PTPN9在肝癌中的作用机制，探讨其作用底物是下一步研究的关键。

由于本研究为回顾性研究，在患者选择上可能有选择性偏倚，需要多中心大量标本的长期临床研究。