骨髓间充质干细胞(MSC)是一类来源于骨髓的具有多向分化潜能的干细胞，具有自我更新、组织再生和抗炎修复等功能。研究表明，MSC经诱导分化后性别决定区Y框蛋白9(Sox9)、Ⅱ型胶原及缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的表达水平上调，提示其具有转化为类髓核细胞的潜能[1]。MSC移植修复椎间盘退变疾病的重要机制是，在椎间盘微环境中MSC向类髓核细胞分化并增加基质大分子的合成。MSC来源广泛、体外培养可诱导类髓核细胞分化，是一种非常有前景的可应用于临床治疗椎间盘退变疾病的种子细胞。微小RNA(miR)是一类含有18~24个核苷酸的非编码RNA，通过与靶基因mRNA 3'端非翻译区(3’UTR)的互补序列以碱基配对方式执行降解靶基因或抑制其翻译的功能，参与调控MSC分化过程中的多种生物学过程[2-4]。本研究通过在线软件预测miR-124的靶基因，发现活化T细胞核因子c1(NFATc1)是其中一个潜在靶点。NFAT家族是一类具有广泛生理功能的转录因子，在成软骨分化过程中，NFATc1能促进软骨基因表达[5]。NFATc1广泛参与MSC生长、分化的生物学过程，特别是在成软骨过程中有基因调控的功能[6]。由此推测，miR-124可能通过靶向调控NFATc1表达促进人MSC向软骨细胞分化。本研究采用成软骨分化诱导培养体系诱导C3H10T1/2细胞向成软骨细胞分化，并探究miR-124在此过程是否通过调控NFATc1靶基因发挥生物学作用。
材料与方法 一、主要材料间充质干细胞株C3H10T1/2细胞系(中山大学骨科研究所提供)；高糖型DMEM培养基、10%胎牛血清购自美国HyClone公司；谷氨酰胺购自美国Gibco公司；胰酶、0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)、抗坏血酸、青霉素链霉素双抗、β-甘油磷酸钠、地塞米松购自美国Sigma公司；pmiR-RB-REPORTTM质粒载体、ribo FECTTM CP转染试剂盒购自广州锐博生物科技有限公司；LipofectamineTM2000转染试剂盒及Trizol购于美国Invitrogen公司。Spe Ⅰ、Hind Ⅲ、T4 DNA连接酶和SYBR Premix ExTaqTM定量PCR试剂均为大连宝生物公司产品。实时定量PCR miR检测试剂盒购自广州天根生物公司。miR-124模拟物(mimics)及抑制物(inhibitors)为美国Ambion公司产品。定点突变试剂盒购自美国Stratagene公司。双荧光素酶活性检测试剂盒购自美国Promega公司。Smad4抗体和GAPDH抗体购自美国CST公司。NFATc1小干扰RNA(siRNA)由美国Invitorgen公司合成，引物合成及测序由深圳达生生物科技公司完成。
二、方法 1. 细胞培养与软骨诱导分化以离心法进行软骨微团的构建，具体操作步骤参照文献[7]进行。小鼠C3H10T1/2细胞株经复苏后室温离心收集沉淀，用含10%胎牛血清的高糖型DMEM培养液混悬于37℃、5%CO2静置培养，待细胞融合至80%~90%，在胰酶消化下进行传代，每3 d更换培养液1次。将培养的C3H10T1/2细胞分为对照组与成软骨诱导组，分别加入含2%胎牛血清的DMEM和软骨诱导液诱导培养。每3 d换液1次，于第0、7、10、14日收集细胞微球进行基因表达检测。
2. 双荧光素酶报告基因构建及检测使用在线靶基因预测软件(PicTar、TargetScan、miRanda、miRDB)，预测NFATc1 mRNA的3'UTR上173~185 nt为miR-124的结合位点(GCACTTT)。人工合成NFATc1 mRNA 3'UTR区的靶点野生型序列(Wt)以及定点突变的突变序列(Mut, GCACTTT→CGTGAAA)；XhoⅠ及NotⅠ双酶切pmiR-RB-REPORTTM质粒，再将Wt和Mut基因片段分别克隆到酶切后的pmiR-RBREPORTTM载体中，构建重组质粒pNFATc1-Wt或pNFATc1-Mut；基因测序确认重组质粒载体构建成功。按照试剂盒说明书突变NFATc1 3'UTR上miR-124结合位点，构建突变型pGL3-Mut-NFATc1真核表达载体。
取培养的C3H10T1/2细胞，根据转染质粒的不同分为4组：①pNFATc1-Wt质粒对照组，为转染pNFATc1-Wt质粒及miR-124 mimics对照；②pNFATc1-Wt质粒实验组，为转染pNFATc1-Wt质粒和miR-124 inhibitors；③pNFATc1-Mut质粒对照组，为转染pNFATc1-Mut质粒与miR-124 mimics对照；④pNFATc1-Mut质粒实验组，为转染pNFATc1-Mut质粒与miR-124 inhibitors。各组转染24 h后收集细胞，用双荧光素酶报告基因系统检测各组细胞的荧光素酶活性。每组实验重复3次，结果取平均值。另外，将NFATc1的3'UTR用XhoI/NotI点双酶切，插入到psiCHECKTM-2质粒中复制，与此相关的NFATc1 3'UTR片段被融合到荧光素酶中，并被转移到C3H10T1/2细胞，根据转染质粒分为不转染对照组(空白对照组)、miR-124 mimics组、miR-124 inhibitors组、pNFATc1-Wt质粒或pNFATc1-Mut组(正常对照组)、pNFATc1-Wt质粒或pNFATc1-Mut质粒加miR-124 inhibitors组(正常对照inhibitors组)，分析miR-124对NFATc1荧光素酶活性的影响。
3. 实时定量PCR检测在成软骨诱导分化第0、7、10、14日收集C3H10T1/2细胞微球，按RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，并检测总RNA的含量及纯度，再按照逆转录试剂盒说明书进行逆转录，合成模板DNA第一链，实时定量PCR扩增目的基因，引物序列见表 1。反应条件为95℃10 min，95℃15 s，60℃ 30 s，72℃ 20 s，40个循环，内参为18 s。一步加A法逆转录miR，反应条件为95℃ 30 s，95℃ 3 s，60℃ 30 s，40个循环，内参为U6。上下游引物序列分别为5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'和5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'，使用2-ΔΔCt法计算基因相对表达量。每组实验重复3次，结果取平均值。记录软骨分化的相关标志基因Aggrecan、Ⅱ型胶原蛋白(Col2a1)和Ⅹ型胶原蛋白(Col10a1)及Sox9 mRNA表达水平。另外，取成软骨诱导7 d的C3H10T1/2细胞转染pNFATc1-Wt质粒(Control组)、pNFATc1-Wt质粒及miR-124 mimics(miR-124组)、经siRNA干预的pNFATc1-Wt质粒(si-NFATc1组)，按前述方法检测NFATc1 mRNA表达水平。此外，取成软骨诱导7 d的C3H10T1/2细胞，转染miR-124 mimics和(或)pNFATc1-Wt质粒，转染成功后分别加入miR-124 mimics 0、50、100 nmol/L miR-124 mimics或inhibitors培养24 h，用前述同样方法分析各组NFATc1和miR-124 mRNA表达水平。
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表 1 PCR引物序列 |
提取各组细胞的总蛋白，测定蛋白浓度，加4倍SDS上样缓冲液8 μl和二硫苏糖醇2 μl混匀沸水浴5 min后作十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺SDS-PAGE凝胶电泳电泳，用电转印仪(100 V电压)电泳将凝胶上的蛋白转印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。将蛋白Marker剪下，避光保存，余下膜用5%脱脂牛奶室温封闭1 h，TBST缓冲液洗涤3次后，一抗4℃孵育过夜，TBST缓冲液再次洗涤3次，加入二抗室温孵育2 h，同前洗涤。按体积比1:1混合ECL试剂盒中A液和B液，混合液铺在膜表面，凝胶成像系统曝光，Quantity one软件分析结果。
三、统计学处理采用SPSS 20.0分析数据。计量资料以x±s表示，组内不同时间点间比较采用配对t检验，2组间比较采用成组t检验，多组比较先行方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
结果 一、C3H10T1/2软骨分化相关基因及蛋白表达的变化成软骨诱导组中，在成软骨诱导分化第7、10、14日的软骨分化相关基因Aggrecan mRNA表达水平均逐渐升高(与诱导前比较，t分别为30.274、46.132、160.752，P均＜0.001)；Col2a1 mRNA相对表达量在第7、10日升高(与诱导前比较，t分别为10.246、67.202、45.311，P均＜0.001)，第14日稍下降(与诱导前比较，t=53.244、P＜0.001；与第10日比较，t=2.376、P>0.05)；Col10a1第7、10日增加缓慢(与诱导前比较，P均>0.05)，但第14日大幅上调(与诱导前比较，t=330.784，P＜0.001)。软骨分化后, 软骨化基因表达逐渐稳步增加，但并未达到峰值；Sox 9和NFATc1 mRNA表达水平随着软骨分化进展而增加(与对照组0 d及10 d时比较，t分别为65.266、80.232，P均＜0.001)，见图 1A~D。蛋白免疫印迹法显示，成软骨诱导组Col2a1、Sox 9和NFATc1蛋白呈逐渐增强表达，表明软骨发生的进展，而肥厚性标记Col10a1蛋白显示较稳定表达(图 1E)。
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图 1 C3H10T1/2诱导成软骨分化的相关基因表达水平变化 |
通过Targetscan和miRanda等在线软件分析，发现NFATc1是miR-124的潜在靶基因之一，NFATc1 mRNA的3'UTR与miR-124的种子区存在理论上的互补碱基配对序列(图 2A)。转染NFATc1 Wt质粒的对照组荧光素酶活性低于实验组(t=3.837，P＜0.05)；转染NFATc1 Mut质粒的实验组与对照组间荧光素酶活性比较差异无统计学意义(P＞0.05)；转染NFATc1 Wt质粒的实验组NFATc1蛋白表达水平高于对照组(图 2B)，表明miR-124直接作用于NFATc1。
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图 2 miR-124通过靶向NFATc1促进C3H10T1/2细胞软骨分化 A：互补碱基配对序列；B：NFATc1荧光素酶活性检测结果和NFATc1蛋白表达；C：miR-124抑制NFAc1 mRNA和蛋白表达；与共转染NFATc1 Wt质粒的对照组荧光素酶活性比较，*P＜0.01；与Control组比较，#P＜0.01 |
miR-124组与si-NFATc1组的NFATc1 mRNA表达水平均低于Control组(LSD-t分别为5.642、4.338，P均＜0.01)，miR-124组与si-NFATc1组的NFATc1 mRNA表达水平接近(P>0.05)；蛋白免疫印迹检测结果与实时定量PCR结果基本一致(图 2C)，表明miR-124能在C3H10T1/2软骨分化的过程中靶向调控NFATc1表达。
三、抑制或过表达miR-124时C3H10T1/2的NFATc1表达水平变化与未加入miR124 mimics相比，100 nmol/L的miR-124 mimics加入C3H10T1/2细胞后，miR-124 mRNA表达水平约增加60倍，而NFATc1 mRNA表达水平约降低60%(图 3A)。当100 nmol/L miR-124 inhibitors加入C3H10T1/2细胞时，与未加入时相比，miR-124 mRNA表达水平减少了大约60%，而NFATc1增加了大约1倍(图 3B)。转染NFATc1-Wt质粒的miR-124 mimics组NFATc1荧光素酶活性低于其他4组(F=8.256，LSD-t分别为5.436、7.442、3.433、6.282，P均＜0.05)，转染NFATc1-Mut质粒的miR-124 mimics组NFATc1荧光素酶活性与其他4组相近(P均>0.05)，表明miR-124可作为NFATc1的抑制剂(图 3C)。
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图 3 干扰NFATc1或过表达miR-124时C3H10T1/2的NFATc1表达水平变化 与其他4组比较，*P＜0.05 |
C3H10T1/2细胞系是一种小鼠胚胎源性间充质干细胞，具有多向分化潜能，转染效率高且稳定，易获得大量转染成功的活细胞，现已广泛用于研究MSC分化潜能的实验中[8]。miR作为一类重要的转录后调控因子，在MSC的分化过程中参与调控细胞的多种生物学过程[9-10]。已有研究发现，miR在调控MSC或前体细胞成软骨、成骨及成脂的分化过程中发挥重要生物学功能[11]。miR-124能抑制MSC向软骨分化[12]。上述研究证实，miR可通过抑制靶基因的表达参与MSC分化的调控。然而其中的分子机制和调控的靶基因尚不清楚。本课题组前期实验首先诱导的C3H10T1/2细胞向软骨的定向分化，在此过程中发现miR-124表达逐渐下调，提示其在MSC软骨分化中可能具有重要的调控作用；然后通过生物信息学分析预测出miR-124潜在的其中一个靶基因NFATc1。本研究亦显示，软骨分化后NFATc1和软骨化相关基因及蛋白表达逐渐稳步增加。
本研究将NFATc1 3'-UTR克隆入荧光素酶报告载体并且与miR-124共转染C3H10T1/2细胞，结果显示miR-124抑制NFATc1 mRNA的3'UTR荧光素酶活性，发现其特异性与NFATc1 mRNA的3'UTR相结合。然而在生理状态下，靶基因3'UTR序列中的miR结合位点有可能由于mRNA的构象而被掩盖，导致该miR无法发挥抑制靶基因表达的功能。因此进一步检测该miR与NFATc1 3'UTR的结合能力及其对NFAc1表达的抑制作用，结果表明miR-124能抑制软骨分化过程中的NFATc1 mRNA及蛋白表达，并且其强度与NFATc1 siRNA干扰NFATc1内源性表达一致，证明了miR-124直接靶向调控NFATc1表达。通过功能研究siRNA干扰NFATc1表达能抑制MSC的成软骨化，它能部分模拟miR-124调控MSC软骨分化的功能。另外，蛋白免疫印迹检测结果也显示转染miR-124 mimics后，NFATc1的蛋白相对表达量比对照组明显下调；相反，转染miR-124 inhibitor后NFATc1的蛋白相对表达量与对照组比较则上调，表明在C3H10T1/2细胞成骨分化过程中miR-124通过调控靶基因NFATc1介导MSC向软骨方向分化。
综上所述，本研究运用生物信息学方法对miR-124和NFATc1基因的靶向配对关系进行预测，发现两者靶向配对良好，采用荧光素酶报告系统、实时定量PCR及蛋白免疫印迹法发现miR-124可靶向抑制NFATc1的表达而负向调控C3H10T1/2细胞成软骨分化。鉴于NFATc1是钙形成信号通路中的重要转导因子之一，因此miR-124调控成软骨分化的作用机制可能是通过抑制NFATc1的表达，因此阻碍其下游信号通路的激活，进而抑制MSC的成软骨分化。
| [1] |
Almalki SG, Agrawal DK. Key transcription factors in the differentiation of mesenchymal stem cells[J]. Differentiation, 2016, 92(1-2): 41-51. DOI:10.1016/j.diff.2016.02.005 |
| [2] |
Polakovičová M, Musil P, Laczo E, Hamar D, Kyselovič J. Circulating microRNAs as potential biomarkers of exercise response[J]. Int J Mol Sci, 2016, 17(10): 17-23. |
| [3] |
Zhang Z, Kang Y, Zhang Z, Zhang H, Duan X, Liu J, Li X, Liao W. Expression of microRNAs during chondrogenesis of human adipose-derived stem cells[J]. Osteoarthritis Cartilage, 2012, 20(12): 1638-1646. DOI:10.1016/j.joca.2012.08.024 |
| [4] |
田南南, 杨建新, 陈晓兰. miR-10b介导乳腺癌转移的机制与靶向治疗[J]. 新医学, 2013, 44(1): 8-10. |
| [5] |
Lin SS, Tzeng BH, Lee KR, Smith RJ, Campbell KP, Chen CC. Cav3.2 T-type calcium channel is required for the NFAT-dependent Sox9 expression in tracheal cartilage[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2014, 111(19): E1990-E1998. DOI:10.1073/pnas.1323112111 |
| [6] |
Sitara D, Aliprantis AO. Transcriptional regulation of bone and joint remodeling by NFAT[J]. Immunol Rev, 2010, 233(1): 286-300. DOI:10.1111/imr.2009.233.issue-1 |
| [7] |
Ray P, Chapman SC. Cytoskeletal reorganization drives mesenchymal condensation and regulates downstream molecular signaling[J]. PLoS One, 2015, 10(8): e0134702. DOI:10.1371/journal.pone.0134702 |
| [8] |
Zou F, Xu JC, Wu GH, Zhou LL, Wa QD, Peng JQ, Zou XN. Effects of oncostatin M on cell proliferation and osteogenic differentiation in C3H10T1/2[J]. J Musculoskelet Neuronal Interact, 2016, 16(4): 377-385. |
| [9] |
Zhou X, Wang J, Sun H, Qi Y, Xu W, Luo D, Jin X, Li C, Chen W, Lin Z, Li F, Zhang R, Li G. MicroRNA-99a regulates early chondrogenic differentiation of rat mesenchymal stem cells by targeting the BMPR2 gene[J]. Cell Tissue Res, 2016, 366(1): 143-153. DOI:10.1007/s00441-016-2416-8 |
| [10] |
Hou C, Yang Z, Kang Y, Zhang Z, Fu M, He A, Zhang Z, Liao W. MiR-193b regulates early chondrogenesis by inhibiting the TGF-beta2 signaling pathway[J]. FEBS Lett, 2015, 589(9): 1040-1047. DOI:10.1016/j.febslet.2015.02.017 |
| [11] |
Laine SK, Alm JJ, Virtanen SP, Aro HT, Laitala-Leinonen TK. MicroRNAs miR-96, miR-124, and miR-199a regulate gene expression in human bone marrow-derived mesenchymal stem cells[J]. J Cell Biochem, 2012, 113(8): 2687-2695. DOI:10.1002/jcb.v113.8 |
| [12] |
Mondanizadeh M, Arefian E, Mosayebi G, Saidijam M, Khansarinejad B, Hashemi SM. MicroRNA-124 regulates neuronal differentiation of mesenchymal stem cells by targeting Sp1mRNA[J]. J Cell Biochem, 2015, 116(6): 943-953. DOI:10.1002/jcb.25045 |