膀胱癌指发生在膀胱黏膜上的恶性肿瘤，是泌尿系统最常见的恶性肿瘤。膀胱癌患者的高发年龄是50~70岁，膀胱尿路上皮癌(TCCB)占膀胱癌患者总数的90%以上[1]。70%的患者初诊时为非肌层浸润性尿路上皮癌，局部治疗有效，但仍有20%的患者进展为肌层浸润性尿路上皮癌。另外25%的患者在初诊时即为肌层浸润性尿路上皮癌，5%患者合并远处转移，对于局部晚期和远处转移的患者，现有治疗方案效果欠佳，5年生存率大约为15%[2]。随着人类基因组学研究的逐渐深入，特定的分子和基因标志物正逐渐取代常规的细胞和组织病理成为恶性肿瘤具体分型的依据，这样更有利于揭示膀胱癌发生发展的病理生理过程，寻找针对性更强的诊疗方案。核糖核酸结合基序蛋白8A (RBM8A)基因可通过调控不同mRNA的剪切拼接，参与RNA代谢的多方面功能，对细胞生长、分化、凋亡等过程产生广泛影响[3]，其功能异常直接导致细胞增殖分化障碍。现有研究表明，RBM8A在多种肿瘤中呈高表达[4]。目前尚无RBM8A在膀胱恶性肿瘤中相关研究，笔者在查询Oncomine数据库时发现，RBM8A mRNA在多个膀胱癌组织中表达明显升高。为进一步明确RBM8A与膀胱癌之间的相关性，本研究检测了膀胱尿路上皮癌组织和非癌组织中RBM8A的表达，并分析其与患者临床病理特征的相关性，以探讨RBM8A在膀胱癌发病过程中的作用。
对象与方法 一、研究对象 1. 病例选择标准包括：①2010年1月至2014年6月间在桂平市人民医院住院经病理确诊且保留可供RBM8A检测组织标本的膀胱尿路上皮癌患者；②年龄18~75岁，有完整的临床资料；③美国东部肿瘤协作组(ECOG)体能状况评分≤2分；④无全身远处器官转移，无合并明显的主要器官功能损害；⑤中性粒细胞＞1.5×109/L，血红蛋白≥80 g/L，血小板≥75×109/L，总胆红素＜1.5倍正常值，转氨酶≤2.5倍正常值。
2. 入组对象的一般资料按上述标准共纳入120例膀胱尿路上皮癌患者。其中男82例、女38例，年龄30~75岁、中位年龄65岁；临床分期按AJCC-TNM标准，非浸润性膀胱癌(Ta-T1) 75例、浸润性膀胱癌(T2-T3) 45例；病理分级按WHO标准，G1 68例、G2~G3 52例。本研究经桂平市人民医院医学伦理委员会批准，入组患者均签署知情同意书。
3. 病理标本来源收集上述膀胱尿路上皮癌患者在膀胱癌根治切除术后的病理蜡块。另随机抽取20例远离肿瘤的癌旁组织和10例正常膀胱黏膜作为对照组。
二、检测方法 1. 主要检测仪器包括轮转切片机(Rm2235，LEICA公司)，烤箱(上海跃进医疗器械厂)，微量移液器(Eppendorf公司)，显微镜(B×40型)(Olympus公司)和Motic Med 6.0数码医学图像分析系统(北京麦克奥迪图像技术有限公司)。
2. 主要检测试剂一抗使用鼠抗人单克隆抗体RBM8A (Thermscientific公司)，二抗使用免疫组织化学染色(免疫组化) MaxVisionTM鼠/兔-辣根过氧化物酶(HRP)广谱检测试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司)和二氨联苯胺(DAB)显色试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司)。
3. 免疫组化检测及结果判定将组织石蜡切片按照说明书步骤染色、固定处理，封片后进行后续结果判定。RBM8A主要位于肿瘤细胞胞质，呈深棕黄色或黄褐色颗粒状染色。由2名中级或以上职称的病理科医师采用13点评分进行半定量分析：①按切片中显色细胞数比例计分，无细胞显色为0分、显色细胞占细胞总数 < 10%为1分、显色细胞占细胞总数10% ~49%为2分、显色细胞占细胞总数50% ~79%为3分、显色细胞占细胞总数≥80%为4分；②按切片中细胞显色强度计分，细胞无显色为0分、呈浅黄色(弱染色)为1分、呈棕黄色(中等染色)为2分、呈棕褐色(强染色)为3分。总分为显色细胞数与显色强度评分的乘积，0 ~2分为阴性，大于2分者为阳性 。
三、随访方法对120例膀胱尿路上皮癌患者进行随访分析，记录其肿瘤转移、复发或患者死亡时间。患者相关的随访资料通过电话收集，随访时间从治疗结束出院开始计算，每例患者每半年通过电话随访1次，随访截止日期为2017年6月1日，中位随访时间为48个月。
四、统计学处理使用SPSS 16.0分析数据。计数资料以百分率表示，组间比较采用χ2检验。应用Kaplan-Meier法绘制生存曲线。P＜0.05为差异有统计学意义。
结果 一、RBM8A蛋白在膀胱尿路上皮癌组织和癌旁组织中的表达：免疫组化显示，RBM8A在膀胱尿路上皮癌组织中呈高表达，主要位于肿瘤细胞胞质，呈深棕黄色或黄褐色颗粒状染色(图 1A)；癌旁组织染色较癌组织弱(图 1B)；正常膀胱黏膜组织染色均为阴性(图 1C)。膀胱尿路上皮癌癌组织和癌旁组织的染色阳性率分别为64.2%、10.0%，比较差异有统计学意义(P＜0.001)，见表 1。
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图 1 RBMA8蛋白在膀胱尿路上皮癌、癌旁组织和正常膀胱黏膜的表达情况(免疫组化染色，×40) A：膀胱尿路上皮癌；B：癌旁组织；C：正常膀胱黏膜 |
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表 1 癌旁组织与癌组织RBM8A表达情况比较 |
T2~T3期浸润性膀胱癌患者以RBM8A阳性为主，达77.8%，Ta~T1期RBM8A阳性率仅占56.0%，两者比较差异有统计学意义(P < 0.05)；病理分级G2~G3患者中，RBM8A阳性率为76.9%，高于G1的54.4%，两者比较差异有统计学意义(P＝0.011)。另外，RBM8A表达水平与患者年龄和性别无关(P均＞0.05)，见表 2。
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表 2 不同临床病理特征的膀胱尿路上皮癌患者RBM8A表达情况比较 |
最后一次随访结束时，75例浅表性膀胱癌的患者中，未出现肿瘤复发55例，失访10例；45例浸润性膀胱癌患者中，RBM8A表达阴性的10例中，未出现肿瘤复发4例，RBM8A表达阳性的35例中，未出现肿瘤复发3例，失访4例。RBM8A蛋白表达阳性者术后中位无瘤生存时间为22.7个月，短于RBM8A蛋白表达阴性者的30.0个月，见图 2。
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图 2 RBM8A表达与浸润性膀胱癌患者预后的关系 |
RBM8A编码4个转录子，在细胞内广泛表达，穿梭于胞浆和胞核内。其作为外显子拼接复合体(EJC)中的核心部件，作用是补充人类上游移码突变体(hUpf)到EJC上，从而触发无义介导mRNA降解(NMD)，是NMD发生过程中必不可少的物质[3]。基因组学技术的发展逐渐揭示了RBM8A基因与疾病的关系。以巨核细胞生成障碍导致血小板减少，伴双侧桡骨缺如和出血为主要临床表现的血小板减少伴桡骨缺失综合征(TAR)就是RBM8A基因突变引起的，主要机制之一就是造血细胞的分化成熟障碍，患儿同时也会表现出智力缺陷[7]。在多种中枢神经系统疾病中均发现RBM8A基因的异常表达[8]。Zou等[9]报道，RBM8A与神经细胞的增殖分化密切相关。Silver等[10]发现，RBM8A可能通过破坏有丝分裂纺锤体的完整性，影响染色体的数目和基因组的稳定性，干扰神经系统的正常分化和发育。
近年研究发现，RBM8A在肝癌、非小细胞肺癌等多种癌组织中均呈高表达，并与肿瘤的生物学行为有关[6]。Ishigaki等[11]在对人宫颈癌细胞株(HeLa)及人肺腺癌细胞株(A549)的研究结果显示，沉默RBM8A基因后，肿瘤细胞凋亡增加，增殖活性受抑制，细胞周期停滞在M期，有丝分裂速度减慢，肿瘤细胞的恶性生物学行为发生改变。既往研究显示，肿瘤细胞的分化程度与其恶性程度密切相关，细胞分化程度越低，增殖越活跃，有丝分裂周期越短，恶性程度越高，因此预后越差。上述研究提示，RBM8A广泛参与细胞生长、分化、凋亡等过程，与恶性肿瘤发生、发展密切相关，其中分化成熟障碍可能是RBM8A潜在的作用机制，值得进一步深入探索。
膀胱癌的发生、发展是一个多基因、多阶段、多步骤渐进演化过程，该过程涉及到众多原癌基因的激活、肿瘤抑制基因的突变或失活、细胞凋亡机制紊乱、信号转导通路异常等多因素协同作用 。笔者查询Oncomine数据库(http://www.oncomine.org)发现，RBM8A mRNA在多个膀胱癌组织中表达明显升高，且与MTF2、CASP3、ERCC3和ATR等基因存在共表达关系。在GeneCars数据库(http://www.genecards.org)中可知，MTF2主要影响组蛋白甲基化，处于细胞自我更新和分化调节转录网络中；CASP3编码的是与肿瘤凋亡密切相关的激酶蛋白；ERCC3和ATR编码的是DNA损伤修复相关的蛋白。进一步查询THE HUMAN PROTEIN ATLAS数据库(https://www.proteinatlas.org)发现MTF2、CASP3、ERCC3和ATR蛋白在多种恶性肿瘤中表达升高且与不良预后相关。本研究采用免疫组化检测了膀胱尿路上皮癌组织和癌旁组织中RBM8A的表达。结果显示，在膀胱尿路上皮癌组织中RBM8A阳性率高于癌旁组织、正常膀胱黏膜组织。进一步研究结果显示，肿瘤分化程度越低，RBM8A阳性率越高，浸润性膀胱癌患者术后无瘤生存时间越短。
上述多项研究提示，RBM8A阳性表达与患者的不良预后直接相关，RBM8A可能参与膀胱癌发生过程的早期生物学事件，并在肿瘤的进程中起着重要的作用，但本研究仅检测膀胱癌组织中RBM8A蛋白的表达，其具体作用和机制尚不清楚。后续研究将通过体内细胞试验和体外动物模型进一步深入探讨RBM8A基因与膀胱癌生物学行为之间的关系，寻找其发挥作用的信号通路和上下游的关键基因，以阐明其在恶性肿瘤中的生物学机制，为膀胱癌的早期诊断、靶向治疗、预后判断、复发监测提供新的途径。
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