随着经济的迅速发展及人们生活习惯的改变,糖尿病与结肠癌的发病率日益升高。大量研究表明糖尿病增加结肠癌发生风险,但其机制尚未明确[1]。有研究提示糖尿病状态下肠上皮细胞存在异常增殖,这可能与增加结肠癌的发病风险相关[2]。前期研究显示晚期糖基化终产物受体(RAGE)在糖尿病并发症中起着重要作用,RAGE及其配体高迁移率族蛋白B1 (HMGBl)可能参与了增加糖尿病患者结肠癌发病风险的分子机制[3-5]。有研究表明2型糖尿病患者外周血HMGB1的水平高于非糖尿病人群[6-7]。HMGB1与RAGE结合,激活多条细胞信号转导通路,促进CyclinD1基因转录,加速细胞G期向S期转换,从而促进细胞增殖[8]。丁酸是一种短链脂肪酸,糖尿病小鼠肠道菌群丰度分析显示产丁酸菌明显下降[9]。有研究表明丁酸可以抑制多种结肠癌细胞系的增殖[10]。但目前有关高糖诱导下丁酸对结肠上皮细胞增殖的影响尚未明确。在本实验中,笔者拟研究高糖诱导及丁酸处理对结肠上皮细胞NCM460的增殖、HMGB1和RAGE蛋白表达的影响,探讨丁酸对高糖诱导下NCM460异常增殖的调控作用及机制,为研究糖尿病与结肠癌发生发展的关系提供新思路。
材料与方法 一、细胞人正常结肠上皮细胞株NCM460购自INCell公司; 培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养基中(Gibco公司,美国)。在37℃、5%二氧化碳饱和湿度温箱中培养,每2 d传代1次。
二、主要试剂丁酸(Sigma公司,美国),TotalRNAKit (Invitrogen公司,美国),逆转录PCR试剂盒RTreagentkit (Takara公司,日本),BCA蛋白定量试剂盒(Pierce公司,美国),增强化学发光法(ECL)试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司),单溶液细胞增殖检测试剂盒MTS (Sigma公司,美国),人HMGB1的ELISA试剂盒(北京欣博盛生物科技有限公司)。β-actin单克隆抗体(Epitomics公司,美国),HMGB1多克隆抗体(Cell Signaling Technology,美国),RAGE多克隆抗体(Cell Signaling Technology,美国); 增殖细胞核抗原(PCNA)多克隆抗体(Cell Signaling Technology,美国),羊抗兔二抗(KPL公司,美国)。小干扰RNA (siRNA) -HMGB1和siRNA-NC阴性对照、过表达pcDNA3.1-HMGB1真核表达质粒及其阴性对照pcDNA3.1-NC由苏州吉玛基因股份有限公司设计及合成,LipofectamineTM 2000购于Invitrogen公司。
三、方法 1. 细胞培养与分组复苏NCM460,培养于RPMI 1640培养基中(含10%胎牛血清),传代24 h后,于细胞培养基中分别加入药物干预,并分为5组:5 mmol/L葡萄糖(阴性对照组,NG组),33 mmol/L葡萄糖(高糖组,HG组),33 mmol/L甘露醇(渗透压对照组,MNG组),5 mmol/L葡萄糖及4 mmol/L丁酸(NG-Bu组),33 mmol/L葡萄糖及4 mmol/L丁酸(HG-Bu组)。每日换液,培养48 h后收集细胞,制成单细胞悬液用于进一步实验。
2. 总RNA的提取及实时荧光定量PCR (QPCR)反应收集上述各组细胞,用Trizol法提取各组细胞总RNA,测定RNA浓度及纯度后合成cDNA。以cDNA为模板进行QPCR反应。反应结束后得到各个样本和内参β-actin的Ct值,以目的基因表达的相对定量值(RQ值),即为RNA的相对含量进行统计学分析。PCR引物设计见表 1。
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表 1 引物序列 |
细胞裂解:分别收集上述各组加药干预后的细胞,加入细胞裂解液及蛋白酶抑制剂,于冰上充分裂解细胞30 min,离心后获取蛋白上清,用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离后,将蛋白电转移至PVDF膜上。PVDF膜在5%脱脂奶粉及室温环境下封闭1 h,加一抗于4 ℃过夜,接着加用辣根过氧化酶标记的相应二抗室温温育2 h。用ECL法检测结合的目的条带。用图像分析软件AlphaImager 2200测定印迹区带的光密度。
4. ELISA检测上清按说明书检测细胞培养液中HMGB1的含量。所有样品设立复孔,并在同一批次内检测。
5. MTS实验测定细胞抑制率取对数生长期的NCM460细胞密度调整为1×104/L,接种于96孔板,实验按分组给予不同的处理后分别继续培养24、48、72 h。然后每孔加入10 μl的MTS溶液,继续孵育4 h, 在酶联免疫检测仪以490 nm波长测定各孔吸光度(A),用吸光度表示细胞的增殖活性。
6. 细胞免疫荧光标记将细胞置于24孔板爬片后,用4%多聚甲醛固定,用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次后,用5%牛血清白蛋白(BSA)封闭,加入相应一抗后于4 ℃孵育过夜。第2日,加入荧光二抗,室温避光孵1 h,用4', 6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染细胞核后,放荧光淬灭剂封片,于共聚焦显微镜下观察。
7. 细胞转染与分组将NCM460接种于6孔板中,待细胞密度达到50% ~60%时,根据LipofectamineTM2000试剂盒说明书用无血清培养基完成转染。分组如下:转染无关序列siRNA (siNC组)和干扰组(siHMGB1组),转染重组质粒pcDNA3.1-HMGB1 (plaHMGB1组)及其阴性对照pcDNA3.1-NC (plaNC组),转染6 h后换含血清培养基,继续培养48 h后收集细胞进行后续实验。
四、统计学处理采用SPSS 13.0分析数据,计量资料用x±s表示,2组间比较用t检验; 多组间比较用方差分析,差异具有统计学意义后再采用LSD-t法行两两比较。以P < 0.05为差异有统计学意义。
结果 一、高糖诱导及丁酸干预对NCM460细胞增殖的影响MTS法检测表明,增殖活性在各组间总体比较差异均有统计学意义(F=37.61,P < 0.001),在高糖诱导下,HG组的NCM460细胞增殖活性为2.245±0.088,较NG组的1.060±0.067高(LSD-t= 9.958, P < 0.001);MNG组的增殖活性为1.082±0.101,与NG组比较差异无统计学意义(LSD-t=0.186,P=0.855)。予丁酸干预,NG-Bu组细胞的增殖活性为1.242±0.086,与NG组比较差异无统计学意义(LSD-t=1.536,P=0.140);但在高糖诱导下,HG-Bu组细胞的增殖活性为1.764± 0.071,比无丁酸处理的HG组低(LSD-t=4.059,P=0.001)。见图 1。
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图 1 高糖诱导及丁酸干预对NCM460细胞增殖能力的影响 与NG组比较,*为P<0.001;与HG组比较,&为P=0.001 |
各指标各组间总体比较差异均有统计学意义(HMGB1 mRNA的F= 68.17、P < 0.001,RAGE mRNA的F=76.19、P < 0.001)。NG组的HMGB1和RAGE的mRNA表达量分别为1.090±0.125与1.072±0.115;MNG组的表达量分别为1.288±0.183与1.248±0.136,2组的HMGB1和RAGE的mRNA表达量比较差异均无统计学意义(HMGB1的LSD-t=0.857、P=0.408,RAGE的LSD-t=0.831、P=0.422,图 2A); HG组NCM460的HMGB1和RAGE的mRNA表达量为3.520±0.176与3.198±0.142,与NG组相比均升高(HMGB1的LSD-t= 10.515、P < 0.001,RAGE的LSD-t=11.083、P < 0.001,图 2A)。HG组HMGB1和RAGE的蛋白表达水平均较NG组低(HMGB1的LSD-t=8.690、P < 0.001,RAGE的LSD-t=11.520、P < 0.001,图 2B、C)。
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图 2 NG、MNG、HG组中HMGB1和RAGE的表达情况 A:NG、MNG和HG组细胞HMGB1和RAGE的mRNA表达水平; B~C:NG、MNG和HG组细胞HMGB1和RAGE的蛋白表达水平; 与NG组比较,*为P < 0.05,n=6 |
HG-Bu组中HMGB1的mRNA表达量为0.270±0.051,比无丁酸处理的HG组的HMGB1表达量1.024±0.082低(t=7.719,P < 0.001,图 3A); RAGE的mRNA表达量为0.386±0.054,比无丁酸处理的HG组RAGE的mRNA表达量1.008±0.051低(t=8.372,P < 0.001,图 3A)。经丁酸处理后HMGB1和RAGE的蛋白表达水平均较NG组低(HMGB1的t=9.457、P < 0.001,RAGE的t=7.155、P < 0.001,图 3B、C)。
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图 3 HG、HG-Bu组中HMGB1和RAGE的表达情况 A:HG、HG-Bu组细胞HMGB1和RAGE的mRNA表达水平; B、C:NG、MNG和HG组细胞HMGB1和RAGE的蛋白表达水平; 与HG组比较,*为P<0.05,n=6 |
在NG及MNG组,HMGB1主要在NCM460的胞核表达,细胞质呈弱阳性红色荧光染色(图 4A、B),HG组NCM460胞质红色荧光染色较NG及MNG组强(图 4C); 在高糖诱导同时加入丁酸干预32 h后NCM460胞质的荧光染色较未予丁酸处理弱(图 4D),42 h后NCM460胞质的荧光染色进一步减弱(图 4E)。
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图 4 高糖诱导及丁酸干预对HMGB1在细胞内外表达分布的免疫荧光观察 A:NG组; B:MNG组; C:HG组; D:HG-Bu组(32 h); E: HG-Bu组(42 h); 标尺=5 μm |
HMGB1水平在各组间总体比较差异均有统计学意义(F= 31.79,P < 0.001)。HG组NCM460细胞培养上清中HMGB1含量为(10.460±0.807) ng/ml,比NG组的(2.940±0.526)ng/ml高(LSD-t=8.346,P < 0.001)。HG-Bu组及NG-Bu组细胞培养上清中HMGB1含量分别为(5.760±0.660)ng/ml和(1.102±0.294) ng/ml,分别比无丁酸处理的HG组和NG组的细胞培养上清中HMGB1的水平低(分别为LSD-t=5.216、P < 0.001和LSD-t=2.199、P=0.040),见图 5。
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图 5 高糖诱导及丁酸干预对细胞培养上清中HMGB1水平影响的ELISA结果 与NG组比较,*为P<0.05;与HG组比较,&为P<0.05 |
siRNA转染后,siHMGB1组的HMGB1的mRNA及蛋白表达水平分别为0.246±0.030及(0.147±0.026) ng/ml,较siNC组的1.054±0.060及(0.573±0.050)ng/ml低(分别为t=12.080、P < 0.001,t=7.516、P=0.002,图 6A~C); 质粒转染后,plaHMGB1组HMGB1的mRNA及蛋白表达水平分别为2.758±0.112及(0.650±0.040) ng/ml,较plaNC组的1.050±0.065及(0.197±0.027)ng/ml高(分别为t=13.220、P < 0.001,t=9.297、P < 0.001, 图 6D~F)。以上结果表明siRNA有效干扰了NCM460表达HMGB1,而HMGB1重组质粒有效上调NCM460中HMGB1的表达。
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图 6 HMGB1调控RAGE的表达及NCM460的细胞增殖 A~C:转染后,HMGB1的mRNA和蛋白表达水平下调,与另一组比较,*为P<0.05,n= 6;D~F:HMGB1的mRNA和蛋白表达水平上调,与另一组比较,*为P<0.05,n= 6;G、H:siHMGB1和siNC组RAGE和PCNA的蛋白表达水平, 与另一组比较,*为P<0.05,n= 6;I~K:对照、plaNC和plaHMGB1组RAGE和PCNA的蛋白表达水平,与对照组比较,*为P<0.05,n=6 |
进一步观察调控HMGB1表达后,细胞RAGE表达及细胞增殖的改变情况,结果显示,与siNC组的RAGE表达量1.158±0.080和PCNA表达量0.914±0.070相比,siHMGB1组的0.748±0.069和0.644±0.073均较低(分别为t=3.894、P=0.005,t=2.669、P=0.028,图 6G、H)。
除了高糖诱导外,还同时用丁酸干预plaNC组和plaHMGB1组(高糖诱导无丁酸处理为对照),各指标各组间总体比较差异均有统计学意义(RAGE的F=9.507、P=0.003,PCNA的F=10.880、P=0.002),其中plaNC组的RAGE和PCNA的蛋白表达水平(0.632±0.062) ng/ml及(0.618±0.060)ng/ml较对照组的(1.189±0.123)ng/ml及(0.942±0.065)ng/ml低(RAGE的LSD-t= 3.417、P=0.007,PCNA的LSD-t= 3.232、P=0.007,图 6I~K)。而HMGB1上调后的plaHMGB1组,其细胞RAGE和PCNA的的蛋白表达水平(1.295±0.145)ng/ml及(1.067±0.083) ng/ml与对照组比较差异无统计学意义(RAGE的LSD-t= 0.650、P=0.529,PCNA的LSD-t= 1.253、P=0.235,图 6I~K)。说明上调NCM460的HMGB1表达水平后,丁酸对高糖诱导下表达增加的RAGE蛋白及细胞异常增殖的抑制作用减弱。
讨论探讨丁酸是否可以改善高糖诱导下结肠上皮细胞的异常增殖,可以为降低糖尿病患者的结肠癌发病率提供新思路。在本实验中,笔者证明了丁酸通过下调HMGB1和RAGE来抑制高糖诱导下结肠上皮细胞的异常增殖,提示丁酸及其下游分子HMGB1在糖尿病结直肠癌的预防控制中可能是至关重要的。
在本研究中,加入高糖培养基后的NCM460细胞增殖能力增强(图 1); 同时,NCM460的HMGB1和RAGE表达量升高(图 2)。在高糖诱导下的NCM460的细胞质和细胞培养上清中,HMGB1的表达均升高(图 4、5)。有研究表明,在核内表达的HMGB1可以从细胞核释放到细胞质中,进一步分泌至细胞外基质作为信号分子发挥功能[11-13]。本研究显示高糖诱导下NCM460内存在HMGB1的易位,可能与其参与高糖诱导下NCM460细胞的异常增殖的相关机制有关。
进一步行过表达及抑制表达HMGB1的研究,结果显示,NCM460细胞增殖能力与HMGB1和RAGE表达水平相一致(图 6),提示HMGB1和RAGE可影响NCM460的细胞增殖。这些结果表明高糖可能刺激HMGB1和RAGE的表达,同时促使HMGB1从细胞核分泌到细胞质、细胞外基质与RAGE结合,而HMGB1和RAGE的结合可能引起肠上皮细胞的异常增殖。根据以往的研究结果,Wnt信号通路在调节正常的肠上皮细胞增殖中起关键作用[14]。有研究者揭示了HMGB1/RAGE通路能调节肝癌细胞增殖[15]。本研究结果显示高糖诱导下结肠上皮细胞的异常增殖与HMGB1和RAGE升高有关。
丁酸可通过抑制HMGB1蛋白减弱心肌缺血时的肺损伤或炎症反应,但其中机制尚未明确[16-17]。本研究显示丁酸可以下调高糖诱导下NCM460的HMGB1和RAGE的表达,同时降低高糖诱导下HMGB1在细胞质及细胞培养上清的表达,并且抑制NCM460细胞的异常增殖。这提示丁酸可能通过抑制HMGB1的表达而抑制高糖诱导下肠上皮细胞的异常增殖。另外,本研究显示丁酸只有在高糖诱导下才抑制NCM460细胞的增殖,而不影响正常状态下的细胞增殖。丁酸如何影响细胞增殖的相关机制是复杂的。有研究显示,丁酸涉及许多复杂的分子机制[18-19]。根据本研究与以往的研究结果,笔者推测丁酸可能对正常肠上皮细胞和高糖诱导下肠上皮细胞的增殖调控具有不同的作用。
综上所述,本研究结果显示,高糖诱导下NCM460的HMGB1和RAGE蛋白的表达增加,且与异常的增殖相关,而丁酸可以抑制HMGB1的表达,进而改善NMC460的异常增殖,这为研究糖尿病结肠癌的发生提供了新思路。但丁酸调控肠上皮细胞增殖可能还通过其它信号转导通路实现, 其完整的分子机制与涉及的信号通路还有待于进一步研究。
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