乳腺癌是全球妇女最常见的恶性肿瘤，雌激素受体阳性(ER+)的乳腺癌患者占总比约70%[1]。目前乳腺癌早期诊断方法主要为影像学检查，寻找诊断及判断乳腺癌预后的明星基因十分必要[2]。染色体缩合调控子2 (RCC2)也被称作TD60，位于染色体1p36位点[3]。其在胃癌组织中显著上调，可筛选结直肠癌高危人群，同时也是黑色素瘤复发及生存率的决定因素[4-6]。最近有学者发现RCC2可通过诱导上皮细胞-间充质转化(EMT)促进肺腺癌的转移[7]。尽管RCC2与众多肿瘤的发生相关，但RCC2是否参与乳腺癌的致病至今尚未明确。在本研究中，笔者探究了RCC2是否在乳腺癌的致病过程中发挥作用，以及雌激素是否参与其中，从而为更有效治疗乳腺癌、提高患者生存率提供参考依据。
材料与方法 一、材料 1. 乳腺组织的获取收集2014年6月至2016年12月滕州市中心人民医院保存的18例患者的乳腺组织，其中乳腺癌组织13例(ER+组织8例、ER-组织5例)，乳腺纤维瘤组织5例。18例患者的年龄为41 (20~70)岁。本研究计划经山东省千佛山医院及滕州市中心人民医院医学伦理委员会批准。
2. 细胞株乳腺癌细胞株MCF-7购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。
3. 主要试剂MEM培养基购于美国Corning公司; 无酚红DMEM购于北京迈晨科技有限公司; 葡聚糖-活性炭吸附血清购于以色列BI公司; 胎牛血清购于浙江天杭生物科技股份有限公司; 兔抗人RCC2单克隆抗体购于美国Cell Signaling Technology公司; Cell Counting Kit-8细胞增殖试剂购于日本同仁公司; Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒购于美国BioLegend公司; 雌激素(雌二醇)纯度>99%购于Sigma公司。
二、方法 1. 乳腺癌细胞培养乳腺癌细胞株MCF-7用含10%胎牛血清+0.01 mg/ml牛胰岛素的MEM培养基在恒温培养箱37℃、5%二氧化碳条件下培养。做雌激素相关实验之前，在含5%葡聚糖-活性炭吸附血清的无酚红DMEM中培养MCF-7共3 d。
2. 蛋白免疫印迹法检测RCC2的蛋白表达包括以下步骤：①组织蛋白提取，称量乳腺组织50 mg，加入裂解液充分研磨，冰上裂解30 min，于4℃ 12 000转/分离心30 min。取上清，于95℃变性15 min，于-80℃保存备用。②细胞蛋白提取，转染72 h后收集细胞，操作步骤同上。③蛋白免疫印迹法，取50 μg蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，将蛋白恒流转至PVDF膜上，RCC2单克隆抗体(1: 1 000) 4℃过夜，二抗(1: 5 000) 37℃孵育2 h。用ECL发光液在荧光成像仪检测蛋白表达情况。
3. 小干扰RNA (siRNA)转染将MCF-7铺于6孔板，待细胞贴壁后进行转染。实验分为Allstars siRNA组和RCC2 siRNA组，转染步骤根据HiPerFect Transfection Reagent说明书进行。
4. 实时荧光定量PCR转染48 h后收集细胞，提取RNA。按TOYOBO逆转录试剂盒操作说明书将RNA逆转录为cDNA，采用实时荧光定量PCR检测RCC2的mRNA表达水平。反应体系为SYBR Green 5 μl，ddH2O 2 μl，上下游引物各1 μl，cDNA 1 μl。反应条件为95℃预变性10 min，(95℃ 15 s，60℃ 34 s，72℃ 30 s) ×45 cycle，72℃延伸3 min。
5. Cell Counting Kit-8试剂盒检测细胞增殖转染24 h后收集细胞铺于96孔板。分别于转染0、24、48、72 h向相应孔加入10 μl Cell Counting Kit-8溶液，培养箱孵育3 h。采用酶标仪测定吸光度(OD450)，将数值进行相应统计。
6. Annexin V-FITC/PI流式分析检测细胞凋亡转染48 h后取20×104~50×104个细胞离心，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞3遍，加入100 μl binding buffer重悬，加入FITC 5 μl、PI 10 μl，混匀后室温避光孵育15 min。每管加入400 μl binding buffer，重悬后上机检测。
7. 雌激素刺激实验包括以下步骤：①雌激素的配制，以无水乙醇为溶剂，将雌二醇配制成浓度为10-2 mol/L的储存液。用无酚红DMEM加5%葡聚糖-活性炭吸附处理过的胎牛血清为溶剂配制不同浓度的雌二醇(10-12、10-10、10-8、10-6、10-4 mol/L)以及含0.1%无水乙醇的对照组。②用Cell Counting Kit-8试剂盒检测细胞增殖，方法同上。③用Annexin V-FITC/PI流式分析检测细胞凋亡，方法同上。
三、统计学处理采用SPSS 17.0进行统计分析，正态分布计量资料用x±s表示。完全随机设计的2组样本均数比较采用独立样本t检验; 多组相互独立的样本均数比较采用单因素方差分析，差异有统计学意义者使用LSD-t检验进行两两比较; 同一受试对象不同处理在不同时间点上变化情况的比较采用重复测量资料方差分析，差异有统计学意义者使用LSD-t检验进行两两比较; 采用2×2析因设计的方差分析了解2种处理因素的效应及因素间交互作用。P < 0.05为差异有统计学意义。
结果 一、RCC2在乳腺癌组织中的表达各组间RCC2蛋白表达水平差异有统计学意义(F=10.851，P=0.001)。在此之后多重比较中, 乳腺纤维瘤组织(0.242±0.054)与ER+乳腺癌组织(0.736±0.280)相比RCC2蛋白表达水平低(P=0.001);而与ER-乳腺癌组织(0.352±0.115)相比RCC2蛋白表达水平差异无统计学意义(P=0.404)，见图 1。
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图 1 RCC2在乳腺组织中的表达 a~h代表乳腺癌ER+组织，i~m代表乳腺癌ER-组织，n~r代表乳腺纤维瘤组织 |
与Allstars siRNA组相比，RCC2 siRNA组中RCC2的mRNA水平降低约75%，差异有统计学意义(t=3.177，P=0.019)，见图 2A; 与Allstars siRNA组RCC2的蛋白水平(0.951±0.150)相比，RCC2 siRNA组(0.504±0.313)较其降低约45%，分子量为56 kDa，差异有统计学意义(t=3.251，P=0.017)，见图 2B、C。提示本实验所用si-RCC2能成功抑制MCF-7中RCC2 mRNA及蛋白水平的表达。
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图 2 转染siRNA后MCF-7中RCC2的mRNA、蛋白表达水平 A：RT-PCR检测RCC2 mRNA在MCF7中的表达; B：蛋白免疫印迹法检测RCC2蛋白在MCF7中的表达; C：用ImageJ软件将RCC2蛋白表达量化并用内参校准后的相对蛋白表达程度; 与另一组比较，*为P<0.05 |
RCC2 siRNA组与Allstars siRNA组的细胞增殖比较差异无统计学意义(F处理=0.003，P=0.957)，且处理与时间的交互作用的方差分析结果显示两者的交互作用无统计学意义(F时间*处理=0.03，P=0.992)，见图 3。提示抑制RCC2的表达对MCF-7的细胞增殖无明显影响。
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图 3 Cell Counting Kit-8试剂盒检测MCF-7细胞增殖 |
转染48 h后，RCC2 siRNA组细胞凋亡比例为(16.87±2.00) %，较Allstars siRNA组的(11.63±3.37) %高，比较差异有统计学意义(t=2.679，P=0.037)，见图 4。提示抑制RCC2的表达可促进MCF-7细胞凋亡。
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图 4 Annexin V-FITC/PI流式分析检测MCF-7细胞凋亡 A：Allstars siRNA组; B：RCC2 siRNA组; C：2组凋亡细胞比例; 与Allstars siRNA组比较，*为P=0.037 |
不同浓度雌二醇处理组的MCF-7细胞增殖随时间的变化趋势不同，处理与时间的交互作用的方差分析结果显示其交互作用有统计学意义(F时间*处理=110.323，P < 0.001)，48 h这一阶段细胞增殖率最高、差异最明显，见图 5A及表 1。将48 h不同浓度雌二醇处理的MCF-7与对照组进行比较，差异均有统计学意义(P-12 < 0.001，P-10 < 0.001，P-8 < 0.001，P-6 < 0.001，P-4 < 0.001)。雌二醇抑制细胞凋亡，随雌二醇浓度的升高细胞凋亡越少。当雌二醇浓度达到10-8 mol/L时MCF-7细胞凋亡最少，为1.000±0.200，且与对照组的2.400±0.361相比，差异具有统计学意义(LSD-t=5.881，P=0.004)。此后随雌二醇浓度的升高，细胞凋亡逐渐增加，见图 5B。据此，我们选定处理MCF-7的最佳雌二醇浓度为10-8 mol/L，最佳时间为48 h，并以此浓度探究雌二醇对MCF-7的作用。
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图 5 不同浓度E2对MCF-7细胞增殖、凋亡的影响 A：Cell Counting Kit-8试剂盒检测不同浓度雌二醇作用下细胞增殖; B：Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测不同浓度雌二醇作用下细胞凋亡; 横坐标数值代表雌二醇不同浓度，如“-8”代表雌二醇浓度为10-8mol/L; “CON”代表含0.1%乙醇的对照组; 与对照组比较，**为P=0.004 |
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表 1 1不同时间不同浓度处理下MCF-7的OD450比较(x±s) |
加入10-8 mol/L雌二醇处理MCF-7，分别在0、2、8、48 h收集细胞，检测RCC2的表达。与0 h相比，RCC2的表达量随时间的增加而增加，量化后的RCC2相对蛋白表达量作单因素方差分析在0 h (0.562±0.106)、2 h (0.818±0.676)、8 h (0.806±0.119)、48 h (1.235±0.304)之间差异有统计学意义(F=7.653，P=0.010)。与0 h相比，48 h的RCC2蛋白表达升高，差异有统计学意义(P=0.002)，见图 6。提示雌二醇在MCF-7中可促进RCC2的表达。
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图 6 E2在MCF-7细胞中对RCC2表达的影响 A：蛋白免疫印迹法检测RCC2蛋白表达; B：用ImageJ软件将RCC2蛋白表达量化并用内参校准后的相对蛋白表达程度; 与0 h比较，**为P=0.002 |
MCF-7转染24 h后，加入含0.1%乙醇的无酚红DMEM或10-8mol/L雌二醇处理48 h，观察2种因素对细胞增殖和凋亡的影响，见图 7。析因分析结果显示，雌二醇与RCC2 siRNA 2种因素在MCF-7细胞增殖方面交互效应无统计学意义(F=0.281，P=0.604)，在MCF-7细胞凋亡方面交互效应有统计学意义(F=18.897，P=0.002)。其中加入雌二醇可抑制细胞凋亡(F=108.599，P < 0.001)，加入RCC2 siRNA促进细胞凋亡(F=113.621，P < 0.001)。提示雌二醇促进细胞增殖不是通过调控RCC2实现的，而雌二醇抑制细胞凋亡可能通过调控RCC2实现。
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图 7 雌二醇与RCC2 siRNA共同对MCF-7细胞增殖、凋亡的影响 A：Cell Counting Kit-8试剂盒检测检测细胞增殖; B：Annexin V-FITC/PI流式分析检测细胞凋亡 |
乳腺癌是女性常见癌症死亡原因之一，ER+乳腺癌是中老年乳腺癌的主要类型，雌激素在其致病过程中发挥重大作用[8]。RCC2是染色体乘客复合体(CPC)的一员，目前已知其在胃癌组织、黑色素瘤、肺腺癌、皮肤基底细胞癌患者及结直肠癌高危人群体内显著上调[4-7, 9-10]。在本实验中，笔者通过检测不同类型乳腺组织RCC2蛋白表达情况，发现与乳腺纤维瘤组织相比，ER+乳腺癌组织RCC2表达量更高，而ER－乳腺癌组织与乳腺纤维瘤组织之间RCC2的表达量无明显差异，提示RCC2可能通过提高表达水平参与ER+乳腺癌的发展。
为了探究RCC2在ER+乳腺癌中的生物学功能，笔者选择ER+乳腺癌细胞系MCF-7进行一系列体外细胞功能学实验。结果显示，抑制RCC2在MCF-7中的表达可促进细胞凋亡，但对细胞增殖无明显影响，说明抑制RCC2可影响乳腺癌细胞系MCF-7的凋亡。有研究显示，RCC2参与细胞有丝分裂和纺锤体的组装[9, 11]。此外，RCC2作为纤维蛋白依赖的黏附信号通路调控者参与调控Rac1和Arf6，从而影响细胞扩散与定向迁移[12-15]。关于RCC2是通过何种途径调控细胞凋亡，Bruun等[5]认为抑制RCC2促进细胞凋亡这一现象可能与细胞有丝分裂有关，而RCC2作为CPC的一员与凋亡抑制基因Survivin等共同参与细胞有丝分裂和纺锤体的组装，因此设想RCC2与Survivin共同参与有丝分裂，并通过影响细胞有丝分裂而调控细胞凋亡[9, 11, 16]。但具体通过何种通路调控尚需作进一步探索。
鉴于ER+乳腺癌细胞ER+的特征，用最佳浓度的雌激素(雌二醇=10-8mol/L)刺激MCF-7，细胞的增殖能力明显增强，凋亡能力明显减弱，提示雌激素能够影响ER+乳腺癌细胞的增殖和凋亡。为了探究雌激素是否通过RCC2影响ER+乳腺癌细胞生物学功能，笔者用最佳浓度的雌激素作用于MCF-7，发现MCF-7中RCC2的表达量随加入雌激素时间的增加而增加，说明雌激素可在MCF-7中调控RCC2，促进RCC2的表达。在抑制RCC2的基础上加入雌激素刺激MCF-7，观察2种因素共同作用于MCF-7时细胞增殖和凋亡的变化，结果提示雌二醇抑制细胞凋亡可能通过调控RCC2实现，而雌二醇促进细胞增殖并非通过调控RCC2实现。
综上所述，本研究结果显示了RCC2在ER+乳腺癌细胞中高表达，并影响ER+乳腺癌细胞凋亡，雌激素可能通过调控RCC2表达来抑制细胞凋亡从而促进ER+乳腺癌的癌变进程。
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