炎症性肠病(IBD)是一组慢性肠道非特异性免疫炎症性疾病，其病理生理的本质是在肠道中有大量的各种炎症细胞浸润以及由其引发的各种炎症因子的释放，造成肠道黏膜的损伤与上皮细胞修复并存。CC趋化因子受体5(CCR5)是趋化因子受体的一种，其可调节各种细胞因子的产生，促使多种炎症细胞的趋化与激活，在IBD、哮喘、类风湿性关节炎等多种自身免疫性疾病的发病过程中发挥重要的作用^[1-5]。核转录因子-κB(NF-κB)作为炎症与免疫反应的重要调控因子，同样参与了IBD的病理生理发展过程^[6]。在我们前期的研究中发现，CCR5与IBD密切相关，在活动期IBD肠黏膜中高表达，并采用噬菌体肽库展示技术，已成功筛选出2条分别与CCR5第一、第二胞外环特异性结合的生物活性模拟肽^[7-8]。本研究在此基础上进一步研究这两条短肽对三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的大鼠结肠炎的炎症细胞浸润及NF-κB/TNF-α信号通路的影响。

材料与方法 一、实验动物

健康成年雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠40只，重量(200±20)g，购自中山大学实验动物中心，动物实验伦理批准编号为IACUC-DB-16-0313，饲养条件为SPF级。

二、主要试剂与仪器

5%TNBS购自Sigma公司；Trizol RNA提取试剂盒、Premix Taq PCR试剂盒及Real-time PCR试剂盒购自Takara公司；NF-κB通路抗体试剂盒[包括兔抗鼠IKKβ, Phospho-IKK α/β(Ser176/180), p65, Phospho-p65(Ser536), IκBα以及Phospho-IκBα(Ser32)抗体]购自Cell Signaling Technology公司；兔抗鼠TNF-α, β-actin抗体购自Novus公司；CCR5第一、第二胞外环的两条活性模拟短肽由上海吉尔生化有限公司合成，纯度为95%，其序列分别为GHWKVWL(简称GH)，HYIDFRW(简称HY)。实时荧光定量PCR仪(Light Cycler96)。

三、方法 1. 实验分组

SD大鼠在经过1周的适应性饲养后，随机分为以下4组：正常对照组(Normal组)、模型组(Model组)、GH短肽治疗组(GH组)、HY短肽治疗组(HY组)。

2. IBD动物模型的建立

在经典的TNBS造模方法的基础上稍加改动^[9]。具体方法大致为：造模前大鼠禁食不禁水24 h，10%水合氯醛麻醉，经石蜡油润滑后，将16号大鼠灌胃针由肛门轻轻插入肠腔约8 cm，缓慢灌入预先配好的灌肠液(按大鼠100 mg/kg的TNBS与等体积乙醇混合而成)，灌入完毕后保持大鼠倒置5 min，然后将大鼠以头低尾高约呈30°的体位放回于笼中垫料上，自然苏醒，恢复自由饮食。本实验方案经中山大学实验动物管理与使用委员会以及实验动物伦理委员会的批准。

3. 给药与取材

在经TNBS造模后的第3日，2个治疗组分别经大鼠尾静脉给予GH短肽(35 mg/kg)和HY短肽(25 mg/kg)，而正常对照组和模型组的大鼠则用尾静脉注射0.9%生理盐水代替。给药时间为每日1次，连续7 d给药。给药浓度的选择则是根据我们先前的实验结果^[10]。在TNBS造模后的第14日，通过10%水合氯醛以腹腔注射过量麻醉药处死大鼠，取大鼠全结肠，沿肠系膜剪开后，用预冷生理盐水清洗。之后在模型及治疗组的病变边缘处和正常对照组的对应肠段取材，所取组织一部分用于病理学检测；另一部分于-80°冰箱保存，用于后续的分子生物学检测。

4. 组织学评价

新鲜组织4%多聚甲醛固定过夜，石蜡包埋，切片(厚度为5 μm)，苏木素-伊红染色后，在显微镜下观察。镜下的评价内容包括溃疡、炎症程度和范围以及炎症细胞的计数。纳入计数的炎症细胞包括中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞以及巨噬细胞，计数方法为在×400高倍镜下随机选取10个独立视野，统计上述各炎症细胞的数目。

5. 蛋白提取与蛋白免疫印迹法

总蛋白通过RIPA裂解液提取。通过BCA法测定蛋白浓度后，将等量的蛋白样本与相应体积的loading buffer相混合成20 μl体系，加入SDS-PAGE凝胶中电泳(初为恒压60 V，后为恒压110 V)，再转膜至PVDF膜上(恒流250 mA，100 min，PVDF膜孔径为0.45 μm)。接着放入5%脱脂牛奶中室温封闭1 h，后加入相应的一抗(抗体稀释比例均为1:1 000)，4℃过夜。第2日经过TBST洗膜后，加入二抗(抗体稀释比例为1:5 000)室温孵育1 h。最后通过ECL化学发光法显影，并拍照保存结果。条带结果分析通过ImageJ软件进行灰度值分析比较。以β-actin作为总蛋白的内参。

6. 实时逆转录PCR

通过Trizol法提取结肠组织总RNA，然后通过逆转录试剂盒，合成cDNA。接着加入目标基因相对应的引物(引物序列见表 1)，对各目标基因进行PCR扩增，通过检测相结合SYBR染料的信号，得到对应的循环数Ct值。PCR的反应体系为：1 μl cDNA、5 μl 2×Sybr Green Premix Ex Taq试剂、0.4 μl正向引物和0.4 μl反向引物，无菌双蒸水补足至10 μl。PCR扩增参数为：95℃30 s，95℃5 s，60℃ 20 s，40个循环。内参基因为β-actin。最后结果的分析计算采用2^-ΔΔCt法计算各基因表达的相对变化^[11]。

四、统计学处理

统计学分析采用SPSS 22.0。计量数据以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结果 一、CCR5短肽对大鼠结肠炎的组织学和炎症细胞浸润的影响

在显微镜下，与正常对照组相比，模型组可观察到溃疡形成，上皮缺损，隐窝损伤，以及累及结肠黏膜全层的严重的炎症反应，并伴随着大量的中性粒细胞和淋巴细胞浸润，以及一定数量的巨噬细胞和嗜酸性粒细胞浸润(图 1A、B)。在GH短肽治疗组和HY短肽治疗组中，炎症则主要局限于黏膜和黏膜下层(图 1C、D)，并且与模型组相比，2个短肽治疗组均表现为不同程度的中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞浸润程度减少(P均＜0.05)，但嗜酸性粒细胞则无明显变化。另外，GH短肽治疗组和HY短肽治疗组各炎症细胞的数量比较差异并没有统计学意义。各炎症细胞计数的结果见表 2。

二、CCR5两短肽对NF-κB/TNF-α信号通路相关蛋白的影响

4组间p-IKKα、p-p65、IκBα、p-IκBα、TNF-α比较，差异有统计学意义(F值分别为11.08、223.40、9.69、31.78、252.10，P均 < 0.01)。其中，与正常对照组相比，模型组大鼠p-IKK，p-p65，p-IκBα和TNF-α蛋白水平分别约为正常对照组的1.3倍、2.0倍、1.7倍和1.7倍，而IκBα蛋白水平则下降(P均＜0.05)，提示模型组IκBα的降解和NF-κB通路的显著激活。与此相反，与模型组相比，GH或HY短肽治疗均可不同程度地引起p-IKK、p-p65、p-IκBα和TNF-α蛋白水平的下降。而短肽治疗组和正常对照组的IκBα水平差异则没有统计学意义，提示短肽治疗组可抑制IκBα的降解。另外，4个组的IKK和p65的蛋白水平差异均没有统计学意义(F值分别为2.58和3.01，P均>0.05，见图 2)。

三、CCR5短肽对NF-κB/TNF-α信号通路相关基因的影响

通过Real time-PCR测定了包括了p105、p100、p65、IKK和TNF-α在内的NF-κB/TNF-α通路相关基因的相对表达水平(图 3)。4组间p105、p100、IKK和TNF-α比较，差异有统计学意义(F值分别为343.80、29.92、301.51和19.98，P均 < 0.01)。其中，从图中可知，模型组大鼠p105、p100、IKK以及TNF-α的mRNA水平较之正常对照组升高(P均＜0.01)，分别约为正常对照组的16.0倍、3.8倍、8.0倍和6.8倍。与此相反，GH组和HY组的大鼠p105、p100、IKK以及TNF-α的mRNA水平较之模型组则出现了下降(P均＜0.01)。另外，4组之间p65的mRNA表达水平差异没有统计学意义(F=3.13，P＞0.05)。

讨论

CCR5是一种G蛋白偶联受体，在结构上包含一个N末端，3个胞外环(分别为ECL1，ECL2和ECL3)，七次跨膜的α螺旋结构域，3个胞内环，以及胞内的C端，其中胞内区的羧基末端含丝氨酸/苏氨酸，可发生磷酸化，从而与G蛋白相偶联，参与MAPK、JAK-STAT、NF-κB等信号转导通路的调控^[12]。

在哺乳动物中，NF-κB家族主要由5种蛋白组成，包括RelA(即p65)、c-Rel、RelB、NF-κB1(p105/p50)和NF-κB2 (p100/p52)。其中p105和p100分别为p50和p52的前体。这5种蛋白可任意两两组合成同源二聚体或异源二聚体，但以p50-p65异二聚体最为常见^[13]。在静息状态下，NF-κB与抑制性蛋白IκB紧密结合，以无活性状态存在于细胞质当中。在炎性信号的刺激下(如TNF-α, LPS, IL-1等)，IKK可被激活。接着IKK催化IκB发生磷酸化，进而IκB可被泛素标记，从而被转运到蛋白酶体发生降解，释放出游离的NF-κB。之后，游离的NF-κB便可通过核孔复合物在核转位序列的介导下转位入核，对多种炎症与免疫相关基因(包括IL-1β和TNF-α等)的转录发挥调控作用^[14]。

迄今为止，已有许多研究探索了CCR5与IBD之间的关系。有研究发现，TAK-779(一种非肽类小分子CCR5拮抗剂)可缓解葡聚糖硫酸钠诱导的动物结肠炎，抑制单核/巨噬细胞的浸润和促炎因子如IL-1β和IL-6的产生^[15]。在人类IBD的研究中也发现了相似的结果：CCR5在人类IBD患者的肠黏膜中高度表达，且表达量与疾病的活动度相关^[7]。这些实验的研究结果均提示了CCR5在IBD发病过程中所扮演的重要角色，同时也提示了抑制CCR5可成为IBD治疗的新思路。

时至今日，已有多种CCR5抑制剂被开发，主要包括趋化因子修饰衍生物，非肽类小分子化合物，单克隆抗体和短肽类化合物^[15]。其中本研究所采用的短肽类拮抗剂，它可与CCR5受体的胞外结构高度特异性结合，亲和力及安全性均较高，生产成本较低等优势。因此，我们通过噬菌体肽库展示技术筛选并合成了两条特异性结合CCR5胞外环的短肽，并探究了它们在大鼠结肠炎中的治疗效果^[8]。

本研究发现，与模型组相比，2个短肽治疗组均出现不同程度炎症明显范围缩小，中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞浸润程度的明显下降。既往研究已发现CCR5广泛表达于树突状细胞、单核/巨噬细胞、中性粒细胞以及效应和调节性T细胞等细胞膜的表面。结合这些研究结果，本研究表明CCR5与结肠炎的中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞迁移浸润作用密切相关，而特异性结合CCR5胞外第一、第二环的两条短肽可在一定程度上抑制上述炎症细胞的浸润作用，减轻组织学损伤。

接下来，蛋白免疫印迹法和PCR的结果进一步证实了GH和HY短肽对NF-κB/TNF-α通路的抑制作用，主要表现为抑制IKK、p65以及IκBα的磷酸化，减少p100、p105、IKK和TNF-α的表达，但是p65的总蛋白水平在各组之间并无差异。此前提到，p50-p65异二聚体在与IκB解离后，可通过核孔复合物在NTS的介导下转位入核，故NF-κB通路激活时，p65的总蛋白水平可保持不变，而表现为核内的p65水平升高，因而也解释了本实验中p65的总蛋白水平在各组之间无差异的结果。另外p65基因的表达在4组之间也没有明显差异，也提示了p65基因表达的稳定性以及可能存在着其他对NF-κB通路调节的机制。

值得注意的是，不管是在组织学、蛋白抑或是基因水平，2条短肽GH和HY组之间都没有发现统计学差异。关于CCR5受体的功能性结合位点，不同的研究有不同的观点。早期关于CCR5与HIV-1如何入侵CD4⁺T细胞的研究发现CCR5受体的N端和第二个胞外环(即ECL2)在HIV-1共受体功能中发挥重要作用。而在2013年，Schnur等通过MRI技术绘制并研究了CCR5各胞外结构与其天然配体RANTES相结合的位点和亲和力。就单一结构而言，N端和ECL2与RANTES的亲和力更高。但是ECL1-ECL2共同体与RANTES的亲和力明显强于ECL2单体。这是由于只有ECL1存在时，ECL2才能保持更稳定的构象。也就是说，不管是阻断ECL1还是ECL2中的任意一个，都可以导致CCR5与配体的结合力下降。另外，这一发现也提示了同时阻断ECL1和ECL2可能可以更好地抑制CCR5的功能。

因此，本研究的结果表明CCR5第一、第二胞外环特异性结合的拮抗短肽可通过抑制NF-κB/TNF-α信号通路，抑制TNBS诱导的大鼠结肠炎的炎症细胞的浸润，减轻组织学损伤，所以，CCR5拮抗短肽也许可以成为IBD治疗的新方法。通过进一步的研究和探索2条短肽的药物代谢动力学特点以及两者是否具有协同作用，将有助于未来CCR5拮抗短肽的临床应用。