AMI仍是当今世界范围内的主要健康负担^[1]。PCI是目前AMI的主要治疗手段，但其存在局限性，主要表现在两方面：一是其无法拯救已坏死心肌，难以避免后期心肌病理重构及慢性心衰的发生^[2]。二是存在PCI术后再狭窄的问题，虽然PCI的手术方式不断改进、抗血小板药物及药物洗脱支架的普遍运用已显著降低其发生率，但目前PCI术后再狭窄的发生率仍有5%左右^[3]。近年来干细胞研究为解决AMI上述两个临床问题带来了新的思路，其中心脏来源的干细胞，被认为是最有希望治疗心血管疾病的干细胞之一^[4]。本课题组前期研究已证明，心脏来源的CD51⁺细胞具有较强的自我更新能力和多向分化能力，具有间充质干细胞特性，CD51可作为心脏干细胞的标志物^[5]。移植到AMI小鼠心脏的CD51⁺细胞可促进心肌梗死后心肌修复、血管再生及心功能改善^[6]。本研究在此基础上，进一步对心脏CD51⁺细胞进行研究，通过体外分离培养小鼠心脏CD51⁺细胞，并定向诱导其向血管内皮细胞分化，探讨其分化成内皮细胞的可行性，为其进一步修复血管内皮损伤、治疗PCI术后再狭窄提供理论依据和实验基础。

无特定病原体C57 BL/6乳鼠10只，雌雄不限，日龄为7 d，购自中山大学实验动物中心，实验过程符合伦理学规定。

DMEM/F12培养基(Gibco)，IMDM培养基(Thermo)，B27、EGF、bFGF、β-巯基乙醇、L-谷氨酰胺(Sigma)，CT-1(R & D)，青链霉素、胎牛血清、DNA酶I、胰蛋白酶(Gibco)，Ⅱ型胶原酶(Sigma)，EGM-2培养基(Lonza)：包含EBM-2基础培养基、血管内皮生长因子(VEGF)、人表皮生长因子(hEGF)、R3-胰岛素样生长因子-1(R3-IGF-1)、抗坏血酸、氢化可的松、人成纤维细胞生长因子β(hFGF-β)、2%胎牛血清、庆大霉素/两性霉素-B，流式抗体PE-CD51、APC-CD31(eBioscience)、APC-VEGFR-2(Thermo)，逆转录试剂盒(Thermo)，4%多聚甲醛(博士德生物)，抗小鼠一抗：CD31一抗、vWF一抗、VEGFR-2一抗(Abcam)，荧光二抗：594-抗大鼠、抗兔、抗绵羊IgG抗体(Thermo)，一氧化氮(NO)检测试剂盒(碧云天生物)，BCA蛋白定量试剂盒(Thermo)，基质胶(Corning)。

超净工作台(NUAIR)，自控式CO₂恒温培养箱(NUAIR)，相差倒置显微镜(Olymus)，倒置荧光显微镜(Leica)，流式细胞分选仪(BDInflux)，分析型流式细胞仪(Beckman)，实时荧光定量PCR系统(Roche), 超微量紫外、可见光分光光度计(Nanodrop)。

将7 d大的C57 BL/6小鼠断颈处死后取心脏并将其剪碎，加入Ⅱ型胶原酶和DNA酶Ⅰ，组织细胞匀浆仪将其制成细胞悬液，1 100 r/min离心4 min，HBSS冲洗、离心、过滤、重悬，将其浓度调整为1×10⁸/ml，加入抗小鼠PE- CD51(1:20)流式抗体，4℃避光孵育30 min，清洗后1 100 r/min离心4 min、重悬后用流式细胞分选仪收集CD51⁺细胞。

用心脏干细胞培养基，配方：以6.5:3.5将DMEM/F12培养基和IMDM培养基混合，再加入2% B27、4 ng/ml CT-1、10 μg/ml EGF、160 μg/ml bFGF、1%谷氨酰胺、0.1 mmol/L β巯基乙醇、1%青链霉素。置CO₂温箱中培养，2至3 d换液1次，0.25%胰蛋白酶(含0.02% EDTA)消化传代。

取纯化后第3代心脏CD51⁺细胞，换用EGM-2培养基培养，隔日半量换液，诱导培养20 d后备用。

细胞加入1 ml Trizol吹打后移入新EP管，加入200 μl氯仿，剧烈震荡15 s后室温放置2~3 min；4 ℃ 12 000 r/min离心15 min，吸取上层液移进新EP管，加入500 μl异丙醇，混匀后室温放置10 min；4 ℃ 12 000 r/min离心10 min；沉淀加无水乙醇洗涤、晾干后用DEPC水溶解，测定RNA浓度。逆转录试剂盒合成cDNA。后行荧光定量PCR。引物序列见表 1。循环程序为：95 ℃ 5 min预变性，95 ℃ 30 s进行40个循环，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s并收集荧光信号。

表 1

表 1 小鼠实时荧光定量PCR引物序列信息 引物名称 上游引物序列 下游引物序列 GAPDH CATCACTGCCACCCAGAAGACTG ATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCAG CD31 CCAAAGCCAGTAGCATCATGGTC GGATGGTGAAGTTGGCTACAGG vWF AACAGACGATGGTGGACTCAGC CGATGGACTCACAGGAGCAAGT VEGFR-2 CGAGACCATTGAAGTGACTTGCC TTCCTCACCCTGCGGATAGTCA CD34 AGGACAGCAGTAAGACCACACC GTGTGGAGTTCCAGAGCCTGAA VE-Cadherin GAACGAGGACAGCAACTTCACC GTTAGCGTGCTGGTTCCAGTCA

表 1 小鼠实时荧光定量PCR引物序列信息

细胞用4%多聚甲醛固定后，BSA封闭40 min，其中vWF组需再用0.2% triton-X100穿透10 min，随后各组加入相应一抗抗体并置4℃过夜，次日室温复温后PBS洗3次，每次5 min，再加入相应二抗，室温避光孵育40 min，PBS洗3次，每次5 min，最后DAPI染核4 min，PBS清洗后制成细胞爬片，倒置荧光显微镜下观察并拍照。

细胞消化后分3组，前2组分别加入APC标记的CD31、VEGFR-2流式抗体，4℃避光孵育40 min，PBS洗3次，并做空白对照。第3组细胞先用0.1% triton-X100穿透10 min后，再加入vWF一抗，孵育40 min，PBS洗3次后加入荧光二抗，避光孵育30 min，PBS洗3次，并做阴性对照。最后用流式细胞分析仪检测。

采用Griess法测定细胞NO含量，利用亚硝酸盐与对氨基苯磺酸作用生成的不稳定的化合物再与α-萘胺作用生成红色偶氮化合物，然后测定其540 nm波长下的吸光度，最后通过绘制标准曲线及蛋白浓度定量，得出细胞NO含量。采用碧云天NO检测试剂盒，按说明书步骤进行操作。

基质胶4 ℃溶解并预冷96孔板、枪头，第二日冰上操作：96孔板每孔加入50 μl基质胶(过程避免气泡)，置于温箱30 min，期间消化细胞并计数，调整浓度为2×10⁶~3×10⁶个/ml，随后每孔加50 μl细胞悬液(浓度为1×10⁴~1.5×10⁴个/ml)，置CO₂温箱中培养4~6 h，倒置显微镜下观察并拍照。

采用SPSS 13.0进行数据分析。定量数据以x±s表示，采用配对t检验进行统计分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

在不含FBS的心脏干细胞培养基中，小鼠心脏CD51⁺细胞为大小不一的圆形，胞体折光性强，呈悬浮生长，并可见聚集成球现象。加入2% FBS后出现贴壁现象，细胞体积变大, 形态变为扁平状长梭形，折光性逐渐减弱，并可见涡旋状生长，见图 1。

图 1

图 1 小鼠心脏CD51+细胞形态(×100) A:不含FBS的心脏干细胞培养基中悬浮生长的小鼠心脏CD51+细胞；B：加入2% FBS后贴壁生长的小鼠心脏CD51+细胞

诱导内皮分化后，小鼠心脏CD51⁺细胞形态逐渐变化，表现为胞体逐渐收缩变短，由长梭形变为短梭形或扁平多角形，并排列成铺路石样，细胞边界清楚, 表现出典型的内皮细胞形态特点，见图 2。

图 2

图 2 小鼠心脏CD51+细胞诱导内皮分化后的细胞形态 A: ×50，B：×100

荧光定量PCR结果显示，细胞诱导内皮分化后与诱导前相比，CD31(t=24.529, P=0.002)、CD34(t=6.383, P=0.024)、vWF(t=25.872, P=0.001)、VEGRR-2(t=5.256, P=0.034)、VE-Cadherin(t=5.255, P=0.034)的mRNA相对表达量均增加，见图 3。

图 3

图 3 小鼠心脏CD51+细胞诱导内皮分化前后的内皮相关基因的mRNA相对表达量比较 *P < 0.05

在荧光倒置显微镜下观察诱导内皮分化后细胞的CD31、VEGFR-2、vWF的免疫荧光染色阳性率分别为(81.2±2.6)%、(70.3±2.2)%、(90.4±3.2)%，典型图片见图 4。诱导前细胞内皮相关标志染色均为阴性表达。

图 4

图 4 小鼠心脏CD51+细胞诱导内皮分化后的内皮相关标志的免疫荧光染色(×200) A：CD31；B：VEGFR-2；C：vWF

流式检测结果显示，诱导内皮分化后细胞表型发生变化，与诱导前相比，表达内皮细胞相关标志CD31、VEGFR-2、vWF的细胞比例明显增加，见图 5。

图 5

图 5 流式检测分析小鼠心脏CD51+细胞诱导内皮分化前后的内皮相关标志物的表达 A：CD31；B：VEGFR-2；C：vWF；红色：诱导前；绿色：诱导后

结果显示，诱导内皮分化后细胞的NO含量增加(t=9.549, P=0.011)，是诱导前的近3倍，见图 6。

图 6

图 6 小鼠心脏CD51+细胞诱导内皮分化前后的NO相对含量比较 *P < 0.05

诱导内皮分化后的细胞接种于基质胶后，细胞逐渐贴壁黏附，向四周发散生长并逐渐形成分散的网状，4~6 h后可形成闭合的多边形管腔样结构; 诱导前细胞无形成官腔样结构的能力，见图 7。

图 7

图 7 小鼠心脏CD51+细胞诱导内皮分化前后的体外血管形成能力比较(×50) A：诱导前；B:诱导后

目前，PCI术后再狭窄仍是无法避免且影响远期疗效的重要并发症，可导致心绞痛复发甚至急性冠脉综合征，需要再次血运重建。作为一项微创操作，PCI术中导丝、球囊、支架等都可能会不可避免地对血管造成牵拉、挤压甚至撕裂等损伤，从而导致血管内皮层受到损伤^[7]。研究表明，内皮损伤后，如果不能尽快恢复内皮的完整性，中膜平滑肌则会开始增殖，形成细胞外基质并向内膜迁移覆盖，加上机械性损伤、异物支架的植入会激活炎症反应及血管活性物质从而导致血小板聚集、血栓形成，最终共同导致PCI术后再狭窄的发生^[8-14]。可见，再狭窄发生的核心环节是血管内皮层的损伤。因此，支架植入后加速受损内膜的再内皮化修复是从根本上降低术后再狭窄发生率的有效手段。

近年来干细胞治疗为解决上述临床问题带来了新的思路，目前关于再狭窄的细胞治疗，研究较多的是内皮祖细胞(EPCs)和骨髓间充质干细胞(MSCs)。虽然有报道称它们对促进内膜修复有积极作用，但目前仍有许多不确定因素和争议，如EPCs缺乏表面特异性标志物，其动员、分化、归巢的信号通路及参与其中的细胞因子尚不明确；非选择性骨髓MSCs不仅会促进内皮细胞增殖，还可促进平滑肌增殖，可能反而促进再狭窄的发生^[15-17]。研究显示，肾脏、心脏等多种脏器、组织中存在的MSCs，不但同样有损伤修复能力，而且对其来源的特定脏器、组织的损伤修复能力可能要优于骨髓来源的MSCs^[18]。同时由于心脏和血管在胚胎发育时共同起源于中胚层，所以心脏来源的干细胞，目前被认为是最有希望治疗心血管疾病的干细胞之一。但目前心脏干细胞尚没有统一、明确的表面标记物^[19]。因此，寻找其特异的表面标记物，并证明其对心功能及内皮损伤的修复作用具有重要意义。CD51又称为整合素蛋白αV，其对胚胎器官生成、血管生成等过程起重要的调节作用^[20]。本课题组前期研究已证明，心脏来源的CD51⁺细胞具有较强的自我更新能力和多向分化能力，具有间充质干细胞特性。移植到AMI小鼠心脏的CD51⁺细胞可分化为成熟心肌细胞，并促进梗死区周边血管再生，从而促进心梗后心功能改善。因此，本研究采用心脏CD51⁺细胞作为诱导内皮分化的种子细胞，探讨其诱导分化为内皮细胞的潜力，以期为治疗PCI术后再狭窄提供新的思路和实验基础。

虽然目前干细胞向内皮细胞诱导分化的机制尚未清楚，诱导的条件也不尽相同，但诱导因子中均含有VEGF，即模拟体内内皮细胞分化的微环境，促进内皮基因的开放和表达，从而完成向内皮细胞的诱导分化。本实验在Kuwana等^[21]的诱导方法基础上进一步改进，用包含VEGF、hEGF、R3-IGF-1、hFGF-β等多种因子的EGM-2培养基对小鼠心脏CD51⁺细胞进行诱导培养，发现诱导后细胞形态逐渐变为铺路石样排列的典型内皮细胞形态。实时荧光定量PCR证明诱导后细胞的内皮相关基因的mRNA表达量显著增加，免疫荧光染色、流式表型分析结果均显示诱导后细胞表达内皮特异性标志物，其中除成熟内皮细胞特异性标志CD31、vWF显著增加外，VEGFR-2、VE-Cadherin、CD34也明显增加。VEGFR-2是内皮细胞重要的增殖性标志物，其可维持内皮细胞存活、促进其增殖、阻止其凋亡，进而加快内膜的内皮化，使内膜屏障功能得以尽快恢复^[22]。VE-Cadherin即血管内皮钙黏蛋白，对维持内皮细胞极性和血管完整性起重要作用^[23]。CD34多表达于血管新生旺盛的组织中，对血管新生、维持内皮细胞单层结构有重要作用。这些结果不仅证明了诱导后细胞具有内皮细胞特征, 还说明诱导后细胞将有利于损伤血管内膜屏障的修复。另外，有功能的成熟内皮细胞的重要特征是合成NO、可在基质胶上黏附、迁移并最终形成管腔样结构。本研究采用细胞NO含量测定及基质胶成管实验，均进一步证明了诱导后细胞初步具有血管内皮细胞的生物学功能活性。

综上所述，本实验从多方面证实了心脏来源的CD51⁺细胞具有向内皮细胞分化的潜能，这就为下一步开展动物实验进一步探讨其修复内皮损伤的能力提供了实验基础，也为临床治疗PCI术后再狭窄提供了新的思路和细胞来源。