HBV母婴传播是导致人群携带HBV的主要原因。研究发现，孕妇血清HBeAg阳性和HBV DNA高水平是HBV母婴传播免疫阻断失败的危险因素^[1-2]。然而，并非所有具有高危因素的孕妇所分娩的新生儿都发生免疫阻断失败。HBV母婴阻断失败除了与病原学特征、环境、遗传背景等因素有关外，还可能与宿主存在HBV感染的易感基因有关。有报道，与健康人群相比，慢性乙型肝炎(CHB)患者的HLA基因中存在与HBV在成年人之间水平传播相关的基因型^[3-9]。本研究拟从寻找HBV感染相关易感基因着手，探讨遗传因素对HBV母婴传播免疫阻断失败的影响，现报告如下。

选取2011年1月至2016年3月在中山大学附属第三医院产科出生、母亲血清HBsAg阳性、经联合免疫后发生免疫阻断失败的婴儿为研究对象。病例选择标准：①母亲年龄20岁或以上，孕28~42周，血清HBsAg阳性，本次妊娠为单胎，无严重肝、肾功能异常及其他严重妊娠合并症，血清甲、丙、丁、戊、庚型肝炎系列检查均阴性，妊娠期间未使用抗病毒药物、免疫调节药和细胞毒性药，无长期使用肾上腺皮质激素类药物史，配偶HBsAg阴性；②婴儿发生免疫阻断失败，但无严重的内外科疾病和先天畸形。本研究经中山大学附属第三医院医学伦理委员会批准，所有研究对象的监护人均已签署知情同意书。

免疫阻断失败是指新生儿出生时HBsAg和(或)HBV DNA阳性并持续阳性至7月龄。HBV DNA阳性指血液中的HBV数量超过了HBV-DNA正常值(100 IU/ml)。

新生儿于出生24 h内尽早肌内注射乙肝Ig 100 U，并按0、1、6方案接种重组酵母乙肝疫苗10 μg进行主-被动联合免疫。分别于出生时联合免疫前以及7月龄时采集婴儿肘静脉血，进行HBV血清标志物(HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗HBe、抗-HBc)的检测。

根据文献[3-9]报道，选出HLA-DPB1、HLA-DPB2等2个易感基因上的3个单核苷酸多态性(SNP)位点(rs2281388、rs9277535、rs9366816)作为本研究的目的位点。

受试婴儿7月龄时，抽取的肘静脉血2 ml，置于EDTA管中，混匀后取200 μl用于提取DNA。使用DNA提取试剂盒(血液DNA提取试剂-高敏试剂，和实生物)，按说明书进行操作, 提取基因组DNA，置于-20℃中保存备用。

通过NCBI-Gene数据库(https: //www. ncbi.nlm.nih.gov)下载目的基因的DNA序列，以目的SNP位点为中心，采用primer 3软件设计PCR引物，将设计的扩增引物序列在PubMed数据库中进行blast分析，验证引物的特异性。将特异性高的引物序列(表 1)送华大基因公司进行引物合成。根据引物说明书加入适量双蒸水，将单管扩增引物稀释至终浓度1 μmol/L，置于-20℃中保存备用。

表 1

表 1 HLA基因SNP位点引物序列 位点 F R 产物长度(bp) rs2281388 CCAGGTCAGGAGCACGAGA GGGATTGAGGAAGGCAGGT 543 rs9277535 GGGTTTTAGTAGACAGTAGG TGACCAAAAGGTGTCAATA 645 rs9366816 ATTGCAGGCATGGACCACT TCCACCCTCTGGAGGACAG 551

表 1 HLA基因SNP位点引物序列

采用PCR扩增直接测序法进行目的SNP位点测序。将基因组DNA、引物与PCR反应体系混合，反应成分及比例为3 μl 10倍Ex Taq酶缓冲液，2 μl脱氧核糖核苷三磷酸(2.5 mmol/L)，1 μl上游引物(10 pmol/L)，1 μl下游引物(10 pmol/L)，0.2 μl Ex Taq酶(5 U/μl)，2 μl DNA模板(1 ng/μl)，20.8 μl H₂O。PCR扩增采用ABI 2700扩增仪，扩增条件为：96 ℃预变性10 min，之后10个循环(96 ℃ 30 s，62~52 ℃退火20 s，72 ℃ 30 s)，随后35个循环(96 ℃ 20 s，52 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s)，最后于72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。反应结束后取7 μl产物进行2%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物。以DNA Marker R(B600040，BBI Life Sciences)为DNA片段条带大小及浓度标准品，采用凝胶成像分析系统ZF-258分析PCR扩增产物的片段长度。确认扩增成功后将余下的PCR产物送上海赛默飞公司进行DNA测序。

国际千人基因组计划(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/variation/tools/1000genomes/)，是由中英美德等国科学家共同承担研究任务，绘制了迄今为止最详尽的、最有医学应用价值的人类基因组遗传多态性图谱，其测序人群包含了以广东人群为主的中国南方人群。采用DNAMAN软件对比DNA序列评估测序结果，Chromas软件分析测序峰图，统计目的SNP位点的碱基组成和等位基因比例，计算不同位点的杂合率，并与国际千人基因组计划中的中国南方人群比较。

采用SPSS 22.0处理数据。计数资料以百分率表示，组间比较采用χ²检验。采用二分类Logistic回归模型分析各基因型与儿童感染HBV的关系，计算优势比(OR)和95%可信区间(CI)。P < 0.05为差异有统计学意义。

2011年1月至2016年3月符合纳入标准的免疫阻断失败儿童共12例，其一般资料见表 2。

表 2

表 2 12例免疫阻断失败儿童的一般资料 编号 性别 母亲HBV标志物a 分娩方式 分娩孕周(周) 出生体质量(kg) 喂养方式 1 男 +-+-+ 阴道分娩 39+6 3.20 母乳 2 女 +-+-+ 阴道分娩 39+5 3.40 人工 3 女 +-+-+ 剖宫产 39+6 2.90 人工 4 男 +-+-+ 阴道分娩 40+3 3.20 人工 5 男 +-+-+ 阴道分娩 37+6 2.95 人工 6 女 +-+-+ 阴道分娩 38 3.20 人工 7 女 +--++ 阴道分娩 39+1 2.70 人工 8 男 +--++ 剖宫产 40+4 3.50 人工 9 女 +-+-+ 剖宫产 39+1 4.10 人工 10 男 +-+-+ 剖宫产 38+3 3.30 人工 11 男 +-+-+ 剖宫产 38 3.45 人工 12 男 +-+-+ 剖宫产 38+5 3.00 人工 注：a母亲HBV标志物依次为HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗HBe、抗-HBc

表 2 12例免疫阻断失败儿童的一般资料

单因素分析结果显示：位于HLA-DPB1基因上的rs9277535和HLA-DPB2基因上的rs9366816，其基因型或等位基因频率在免疫阻断失败儿童和中国南方人群比较差异有统计学意义(P均 < 0.05)。免疫阻断失败儿童的rs9277535的GA基因型频率与中国南方人群比较差异有统计学意义(P < 0.05)，且与AA基因型相比，其可能降低了HBV母婴传播风险(OR=0.064，95% CI 0.006~0.641)；免疫阻断失败儿童的rs9366816的C等位基因频率与南方人群比较差异有统计学意义(P < 0.05)，且与T等位基因相比，其可能增加了HBV母婴传播的危险性(OR=2.585，95% CI:1.008~6.629)。另一个SNP位点rs2281388的各基因型及等位基因频率在免疫阻断失败儿童和中国南方人群间比较差异无统计学意义(P＞0.05)，见表 3。

表 3

表 3 HLA基因上3个目的SNP位点在免疫阻断失败儿童中的分布及发病风险 基因 SNP位点 基因型/等位基因 阻断失败儿童[例(%)] 国际千人基因组中国南方人群(%) OR(95% CI) P值 HLA-DPB1 rs2281388 CC 2(17) (40) 1 CT 6(50) (47) 2.591(0.467~14.382) 0.276 TT 4(33) (14) 6.333(0.920~43.618) 0.061 C 10(42) (63) 1 T 14(58) (37) 2.471(0.990~6.163) 0.052 HLA-DPB1 rs9277535 AA 5(42) (15) 1 GA 1(8) (47) 0.064(0.006~0.641) 0.019 GG 6(50) (38) 0.467(0.107~2.036) 0.311 A 11(46) (39) 1 G 13(54) (61) 0.734(0.297~1.812) 0.502 HLA-DPB2 rs9366816 TT 2(17) (33) 1 CT 4(33) (49) 1.304(0.212~8.032) 0.775 CC 6(50) (18) 5.000(0.826~30.281) 0.080 T 8(33) (57) 1 C 16(67) (43) 2.585(1.008~6.629) 0.048

表 3 HLA基因上3个目的SNP位点在免疫阻断失败儿童中的分布及发病风险

中国是HBV感染的高发地区，育龄女性中HBV感染率高达7.18%，从而使HBV母婴传播的风险增加^[10-13]。对HBsAg阳性孕妇所分娩的新生儿进行乙肝Ig和乙肝疫苗的联合免疫，可阻断大部分母婴传播，但仍有婴儿发生免疫阻断失败，成为新的HBV感染者。有研究表明，HBV母婴阻断失败可能和病毒因素、妊娠期阻断方式有关，但与宿主遗传因素的关系仍知之甚少^{[1-2, 14-16]}。自20世纪70年代初以来，HLA被证实为最主要的与感染性疾病易感性相关基因，并作为个体组织细胞的遗传学标志，在抗原识别、免疫应答等方面起着重要的作用。其通过影响抗原提呈等免疫应答过程, 对宿主清除外来病毒如HBV病毒发挥作用, 并可能影响病毒感染的持久化以及感染后病情进展。

2009年，日本全基因组研究中心首次提出HLA-DPB1的rs9277535与日本成年人CHB有关^[3-4]。针对中国人群的研究也表明rs9277535与CHB有关，提出HLA-DP的基因多态性在成年人HBV感染中扮演重要的角色，该研究还证实了rs9277535的A等位基因与HBV的清除有关，能降低中国汉族人罹患CHB的风险^[5-7]。另有研究发现，HLA-DPB2的rs9366816与HBV的持续性感染有关^[8]。2016年Fan等^[9]的研究表明，HLA-DP基因上的rs9277535 GG基因型、rs9366816 TC基因型和rs2281388 GA基因型与成年人HBV持续性感染相关，并进一步发现rs9277535的GA基因型与HBV母婴阻断失败后感染有关。

本研究对12例免疫阻断失败儿童外周血中的3个相关SNP位点进行了PCR扩增测序和分析，并与中国南方人群的基因频率相比，结果显示rs9277535(HLA-DPB1)和rs9366816(HLA-DPB2)的基因型或等位基因频率与中国南方人群比较差异有统计学意义，提示这2个位点可能与免疫阻断失败有关。其中免疫阻断失败儿童的rs9277535的GA基因型频率为8%，远低于中国南方人群的47%，和Fan等^[9]的研究结论一致。他们的研究认为，rs9277535的GA基因型与儿童免疫阻断失败后感染有关。本研究提示，HLA-DPB1基因上rs9277535的GA基因型可能是HBV感染的保护性基因型，具有此基因型者，可能会降低HBV的母婴感染率。既往研究证实，HLA-DPB2基因rs9366816的CT基因型与成年人的HBV持续性感染有关^[8-9]。本研究中，12例免疫阻断失败儿童的rs9366816 CT基因型频率(33%)与中国南方人群(49%)相近。但免疫阻断失败儿童rs9366816的C等位基因频率为67%，高于中国南方人群的基因频率(43%)，提示rs9366816的C等位基因可能是HBV感染的易感基因，不仅能导致成年人的持续性HBV感染，还可能会增加HBV母婴阻断失败的风险。既往研究发现，rs2281388 CT基因型与成年人慢性HBV感染有关^[9]。在本研究免疫阻断失败儿童中的rs2281388 CT基因型频率为50%，与中国南方人群的基因型频率(47%)相近，可能与本研究的样本量较小有关；也可能提示由于儿童的免疫系统与成人相比尚未完全发育，从而存在不同的免疫机制有关，其与儿童HBV母婴传播免疫阻断失败无关。

胎儿由于免疫系统的特殊性，其基因组中是否含有围生期感染HBV的易感基因型尚不明确。本研究中，虽然在免疫阻断失败儿童中发现了2个SNP位点与南方人群中的基因型频率存在差异，但由于病例数较少，尚不能说明其与HBV感染相关，需要在后续的研究中，进一步扩大样本量和增加目的SNP位点，继续探讨遗传因素对HBV母婴阻断失败的影响，进而为在人群中筛选具有遗传易感性的高危个体，并对其采取针对性的预防措施或治疗手段，为减少HBV的母婴传播和控制慢性HBV感染提供理论与实验指导。