糖尿病患者在2013年约达3.82亿，2035年预计达到5.92亿^[1]。白内障是糖尿病的最常见并发症之一，更值得重视的是，白内障已被确定为全球视力障碍和失明的主要原因。对于临床研究与治疗，积极寻找病因是治疗及预防疾病最关键的步骤，因此建立稳定可靠的动物模型进行实验研究，有助于日后降低视力损害及白内障盲的发病率^[2]。半乳糖诱导的白内障大鼠模型已广泛应用，是较好反映人类糖尿病性白内障和年龄相关性白内障的动物模型。半乳糖模型的建模方法一直存在争议，国外学者认为腹腔注射不能够形成糖性白内障^[3]。但是在该领域，我国早期的一些学者发现腹腔注射半乳糖可诱发白内障的形成，还有学者采用球后注射、皮下注射等方法诱发白内障，造模的方式、方法与剂量都不相同，且引起的动物死亡率较高，基本达半数以上^[4]。我们经过一系列的实验摸索，探讨半乳糖的用量及方法，旨在提供稳定可靠且死亡率较低的白内障动物模型制备方法，为日后白内障的实验研究及治疗提供一个参考方案。

SPF级Wistar雄性大鼠3~4周龄48只(中山大学中山眼科动物实验中心提供)，体质量80~100 g，复方托吡卡胺散瞳后，裂隙灯下晶状体澄清透明且无其他眼部疾病。检查实验动物的使用遵循国家《实验动物管理条例》及通过动物伦理委员会的批准。

D-半乳糖(Genview)，灭菌水(中国大冢制药有限公司)，复方托吡卡胺滴眼液(日本参天制药株式会社)；SL-D7/DC-3/IMAGEnet裂隙灯(日本Topcon公司)；恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)；电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)，体重秤(北京赛多利斯仪器系统有限公司)。

经普通颗粒饲料适应性喂养1周后，48只大鼠随机分为8组，每组6只。为了减少左右眼可能发生差异对实验结果的影响，我们对实验中的大鼠进行了双眼的观察研究。各组标为A、B、C、D、E、F、G、H。

每天注射前对每只大鼠称取体质量，体质量精确到小数点后1位，严格按照相应体质量的剂量进行注射。实验剂量如表 1所示，实验周期共30 d。

表 1

表 1 实验方法及剂量 分组 腹腔注射50% D-半乳糖剂量 A、E 10 g/(kg·d) B、F 15 g/(kg·d) C、G 10 g/kg，每日2次 D、H 15 g/kg，每日2次 注：A、B、C、D组第10日开始加喝10% D-半乳糖水。

表 1 实验方法及剂量

不使用麻醉剂及任何镇静药的状态下，每3 d用复方托吡卡胺滴双眼散瞳后，在SL-130裂隙灯对大鼠进行晶状体浑浊程度的观察并记录及拍照，直至实验结束。使用裂隙灯观察者共3名，均为有熟练眼科临床经验且不知晓本次实验内容及进程者，裂隙灯观察采用弥散光照射法^[5]。

根据国际公认的白内障分级，共分为8级^[6]。具体如下：0级，晶状体完全透明，未见任何混浊; 1a级，晶状体出现赤道部环样水泡; 1b级，空泡覆盖前皮质层的范围≥1/3; 1c级，空泡覆盖前层皮质范围≥2/3; 2a级，前层皮质有部分范围透明且仍有空泡存在; 2b级，前层皮质仍有部分透明范围，但不伴有空泡的存在; 3级，均一的皮质性混浊; 4级，晶状体核出现混浊。

3名观察者对大鼠白内障浑浊程度进行评级，统计后改成相对应分数，并采用的浑浊指数进行换算，并取平均值^[7]。浑浊指数= (各级白内障的得分×相应分级的眼数) /组内总眼数。

应用SPSS 23.0进行统计分析，用Shapiro-Wilktest分析数据正态性，非正态分布定量资料用中位数(上、下四分位数)表示，左右眼浑浊指数比较采用符号秩和检验，P < 0.05为差异有统计学意义。8个剂量组之间的浑浊指数比较用H秩和检验，并采用Bonferroni法进行两两对比，P < 0.05/比较次数(0.05/C₈²=0.0018)为差异有统计学意义。用Spearman秩相关分析左右眼浑浊指数与体质量的相关性，P < 0.05为差异有统计学意义。

我们每天造模前对大鼠进行体质量称量并记录，计算各组第30日时总的体质量增长率，见图 1，可见E和F组的体质量增长率最高，说明在一定的半乳糖浓度阈值下，其体质量增长速度与注射半乳糖量的大小有关，注射剂量越小，大鼠的生长发育程度越好；C、D与G、H组的注射浓度较高，体质量增长率低于其余浓度组。以3 d为一时间段计算各组体质量增长率，见表 1，可以看出C~H组的体质量均在3~6 d这个时间段增长速度最快，A组在15~18 d，B组在6~9 d体质量增长速度最快。

图 1

图 1 各组大鼠在第30日时的总体质量增长率

表 1

表 1 各组大鼠每3 d的体质量增长率变化 % 时间(d) A组 B组 C组 D组 E组 F组 G组 H组 1 - - - - - - - - 3 6.86 12.60 -5.26 -14.50 -1.98 9.95 -5.00 -12.83 6 11.68 9.83 36.90a 26.56a 37.22a 25.35a 35.13a 25.27a 9 11.85 12.61a 20.02 -2.01 6.30 12.00 12.15 14.20 12 8.65 8.64 12.80 11.87 20.69 21.10 12.00 14.36 15 17.44a 13.00 8.20 18.97 5.16 5.01 5.95 13.28 18 2.04 0.54 2.09 -12.20 19.65 16.14 14.34 11.37 21 10.84 10.56 -2.03 7.29 6.86 5.63 6.63 6.90 24 6.49 7.11 1.58 9.00 8.63 8.24 5.50 5.93 27 5.23 3.30 3.53 8.01 -0.74 -12.00 -0.70 1.25 30 7.66 9.60 3.30 1.93 3.08 2.6 2.26 2.87 注：“-”表示该组未出现该级的变化；a该组浑浊指数增长速度最快的时间点

表 1 各组大鼠每3 d的体质量增长率变化

裂隙灯观察直至30 d时，A、B、C、D、E、F、G、H的白内障浑浊情况。按之前提到的标准进行记录和统计换算，我们把同一只大鼠的左右眼指数取平均后得到浑浊指数结果如图 2所示。各组内左右眼浑浊指数比较差异无统计学意义(P均>0.05)。A-E组，B-F组, C-G组, D-H组的浑浊指数，即添加半乳糖水喂养与单纯腹腔注射形成的白内障组间无明显差异(P>0.0018), 其余各组之间的浑浊指数的差异具有统计学意义(P < 0.0018)。指数增长变化率如表 3所示。第30日时, A组处于2b级, B组处于4级, C组处于2a级, D组处于3级, E组处1a级, F组处于2a级, G组处于1c级, H组处于3级，各组大鼠第30日时白内障的浑浊情况见图 3。表 2与表 3相比可知，白内障浑浊加重的时间均出现在体质量迅速增长之后。说明随着半乳糖的刺激，大鼠晶状体的浑浊指数也随体质量的增加而增加，体质量的增长与浑浊指数增长秩相关系数r_s=0.98 (P < 0.05)。我们发现除E组外，低剂量组(A、C、G) 75%于第9日时才出现1a级轻度的早期白内障改变，而高剂量组(B、D、H) 75%基本是在第3日就出现1a级改变，F组25%于第9日开始出现1a级改变，且浑浊程度发展较低剂量组更为迅速。其余统计各级出现的时间点见表 4。

图 2

图 2 各组大鼠第30日时白内障浑浊指数变化结果 各组白内障浑浊指数: B>H>A>D>C>F>G>E

图 3

图 3 A、B、C、D、E、F、G、H组大鼠在第30日时白内障的浑浊情况 A、B、C、D、E、F、G、H分别代表各组在第30日时白内障形成的情况；第30日时, A组处于2b级, B组处于4级, C组处于2a级, D组处于3级, E组处1a级, F组处于2a级, G组处于1c级, H组处于3级

表 2

表 2 各组大鼠左右眼浑浊指数的情况中位数(下四分位数，上四分位数) 组别 左眼(n=11) 右眼(n=11) P值 A 2.50(1.00, 6.00) 2.50(1.00, 5.78) 0.06 B 4.58(1.75, 7.25) 4.58(1.75, 7.25) 0.13 C 2.00(1.00, 3.00) 2.00(1.00, 3.00) 0.50 D 4.53(2.60, 6.17) 5.00(2.60, 6.00) 0.45 E 1.00(1.00, 1.33) 1.00(1.00, 1.33) 1.00 F 1.83(1.00, 3.45) 1.83(1.00, 2.83) 0.32 G 1.83(1.00, 3.33) 1.83(1.00, 3.33) 0.25 H 5.20(2.00, 6.80) 5.20(2.00, 6.80) 0.50

表 2 各组大鼠左右眼浑浊指数的情况中位数(下四分位数，上四分位数)

表 3

表 3 各组大鼠在各个时间段混浊指数增长变化 % 时间(d) A组 B组 C组 D组 E组 F组 G组 H组 1 - - - - - - - - 3 0.00 25.00 0.00 40.00 0.00 0.00 0.00 33.33 6 0.00 28.57 0.00 85.71a 0.00 0.00 0.00 50.00a 9 16.70 35.71 100.00a 37.18 0.00 66.70a 83.33a 33.34 12 42.84 19.30 100.00 14.95 0.00 9.96 0.00 41.25 15 49.97 61.77a 100.00 16.26 0.00 0.00 0.00 38.05 18 54.44a 37.28 50.00 23.25 16.67a 15.17 0.00 11.53 21 14.39 5.30 0.00 3.55 0.00 34.20 72.73 10.92 24 33.34 9.44 0.00 0.00 14.25 10.79 5.26 5.70 27 5.65 2.86 80.56 0.68 0.00 27.44 22.51 0.00 30 5.81 0.57 0.00 2.04 0.00 18.33 6.80 0.00 注: “-”表示该组未出现该级的变化，a该组浑浊指数增长速度最快的时间点

表 3 各组大鼠在各个时间段混浊指数增长变化

表 4

表 4 各组大鼠出现各级时的时间 d 分级 A组 B组 C组 D组 E组 F组 G组 H组 1a 9 3 9 3 18 9 9 3 2a 18 9 27 12 - 24 21 15 3 21 18 - 15 - - 27 21 4 - 24 - - - - - - 注: “-”表示该组未出现该级的变化；37.5%(B、D、H)在第3日出现1a级白内障的改变，50%(A、C、F、G)在第9日出现1a级白内障的改变

表 4 各组大鼠出现各级时的时间

本次实验共48只大鼠，至30 d截止，除最低剂量的E组(33.33%)外，各实验组的造模成功率均为100%，A~H各组的死亡率分别为0.00%、33.33%、66.67%、33.33%、0.00%、16.67%、0.00%、16.67%。总死亡率为20.83%，造模成功率为70.83%。E组有4只大鼠(8只眼)未出现白内障的晶状体改变，除了C、E、F组，其余各组均出现3级以上白内障。实验观察至第30日时，各组白内障分级总结见表 5。

表 5

表 5 各组大鼠第30日时到达各级的百分率 % 分级 A组 B组 C组 D组 E组 F组 G组 H组 0 - - - - 66.67 - - - 1a - - - - 33.33 - - - 1b - - - - - - 16.67 - 1c - - - - - 40.00 58.33 - 2a - - 50.00 - - 60.00 16.67 - 2b 33.33 - 50.00 25.00 - - - 20.00 3 66.67 50.00 - 25.00 - - 8.33 80.00 4 - 50.00 - 50.00 - - - - 死亡率 0.00 33.30 66.70 33.30 0.00 16.67 0.00 16.67 成功率 100.00 100.00 100.00 100.00 33.33 100.00 100.00 100.00 注:”-”表示未出现该级的改变

表 5 各组大鼠第30日时到达各级的百分率

WHO组织在1999年提出的“视觉2020”行动，旨在2020年前根治全球可避免盲，防治中首先提到的即是白内障盲，响应“视觉2020”，降低视力损害的患病率，让更多的人避免致盲或复明是医学事业的目标之一^[8]。有临床观察表明，糖尿病患者较非糖尿病患者发生白内障的风险较高，且时间较早。目前，渗透压改变学说引起糖尿病患者晶状体发生浑浊得到了众多学者的认可^[9]。当血糖浓度过高，过多的糖经多元醇通路代谢转化成山梨醇及果糖，这些物质因不易透过晶体囊膜而在晶状体堆积，使晶状体内渗透压增高，晶体吸水膨胀，最后引发白内障的形成。

常用糖尿病性白内障模型建立方法主要有:静脉或腹腔注射链脲佐菌(STZ)；饲喂D-半乳糖；腹腔注射D-半乳糖；皮下注射D-半乳糖；球后注射D-半乳糖。STZ是最早用于研究糖性白内障模型的药物，它易引起较高的死亡率，且因诱导的动物糖尿病白内障模型显示白内障的进展较快，并不利于糖尿病性白内障的研究。D-半乳糖：具有价格合适及稳定等优点。单纯的D-半乳糖喂养的价格昂贵，最重要的是不能保证每只老鼠摄取的剂量相当，我们认为此种方法易造成较大的实验误差。皮下注射、球后注射均可成功诱发白内障^[10-11]。但是我们认为，等同于腹腔注射的高剂量皮下注射，皮下注射吸收较腹腔慢，考虑到大鼠的耐受能力，我们没有采用该种方法。球后注射的操作复杂，可能还会同时引起其他的眼部并发症，且球后注射对眼球本身就是一种外伤刺激，我们认为，该种造模方法无法评估球后注射对诱发白内障的影响程度。腹腔注射方法简易可行，因此曾经成为国内眼科学者广泛使用的方法。在我们严格按照每只大鼠的体质量进行对应剂量的注射的情况下，我们本次研究发现，半乳糖腹腔注射的方法是准确可行的，并不是国外大部分学者认为的不能形成白内障，而死亡率也没有余琛琳等^[4]报道的50%那么高。而有些学者提到不用腹腔注射，用喂养法，因为大多数老鼠病情恶劣甚至死亡，并且模型非常不稳定^[12]。实验过程中，我们确实观察到大鼠会出现多食、多饮、毛发粗糙无光泽、耸背等状态，但一般精神状态及活力良好。有资料表明，选日龄较小的大鼠造模较好，模型复制的成败主要取决于大鼠的日龄, 而与体质量无关。我们在前期实验发现，对基础月龄为3个月的大鼠进行腹腔注射，观察至30 d时，未出现任何晶状体的改变^[13]。故此，我们选用了3周左右的大鼠作为建模对象。以往的文献对半乳糖注射的剂量不确定，也没有一个确切的标准，甚至有同一学者同年发表的两篇研究相同药物对白内障影响的文章中，所用的半乳糖剂量也不同，在文献[14]中所用到的剂量为10 g/ (kg·d), 腹腔注射，而在文献[15]中所用到的剂量为15 g/ (kg·d), 腹腔注射。而观察到的结果几乎相同。我们按文献[16]中提到的方法，将等量的半乳糖溶于4 ml注射用生理盐水并进行腹腔注射，然而我们预实验中第一天按此方法造模的死亡率高达90%。给予的注射半乳糖剂量大小对半乳糖性白内障的形成也有明显影响，据此，我们选用10 g/kg和15 g/kg剂量来制造动物模型。与陈晓光等^[17]和李婧等^[18]研究相同，前期我们发现30%浓度的半乳糖大鼠饮用后容易拒饮并脱水死亡，我们选用了10%的半乳糖饮用水作为辅助药物，在验证饲养是否有助于白内障形成的同时降低了成本。

这些学者在研究白内障模型时都未提及死亡率的问题，我们本次研究不仅有效的证明了腹腔注射半乳糖可以成功的建立白内障动物模型，也发现了降低动物死亡率的方法^[18-19]。本次实验死亡率仅为20.83%，造模成功率为70.83%，是较稳定的半乳糖白内障动物模型。

通过多组浓度的实验，可以看出在一定阈值范围内，注射半乳糖的剂量越大、浓度越高，大鼠的体质量增长越快。结果也可以发现晶状体开始出现浑浊的时间随着体质量增长最高峰的出现而出现。我们可以看出除E组外，其余组均是从第3~9日开始出现白内障的浑浊。以往的文献也表明，半乳糖注射产生赤道部水泡的时间大部分在3~5 d，而我们观察到体质量增长速度最快的阶段大部分在第3日，说明体质量增长和白内障的浑浊指数增长存在一定关系^[20]。高浓度组浑浊指数：B>H>D，说明在高剂量半乳糖的作用下，加喝半乳糖饮用水对白内障的产生没有正向作用。B组每日1次高浓度效果最佳。低浓度组浑浊指数：A>C>G，同样说明了越高浓度的腹腔注射及半乳糖的饮用喂养，对大鼠本身是一种损伤刺激，A组每日1次低浓度形成白内障的效果佳。在D组和H组注射剂量相同，且D组加喝半乳糖饮用水的情况下，H组的浑浊指数大于D组。说明在高剂量半乳糖的作用下，加喝半乳糖饮用水对白内障的产生没有正向作用。C组和G组在注射剂量相同的情况下，浑浊指数在9~15 d出现平台期，且G组的平台期更长，随后才出现较大幅度的增长，可以看出C组在第10日加喝半乳糖饮用水，相比于G组产生白内障的效果更佳。

但是，B组和F组，很明显地看出喝半乳糖与不喝半乳糖的差别。B、H、D、A组增长幅度最大。F、G组几乎重叠在一起，说明每日1次高浓度与每日2次低浓度效果相当，甚至每日1次高浓度(F组)造模的效果略好一些。我们的A~D组选择了国外大部分学者的方法，添加半乳糖饮食，但是在腹腔注射了一定量的基础上，辅助添加半乳糖饮用水，用于判断半乳糖喂养与单纯腹腔注射两种方式之间是否有抵消或促进白内障发展的相互作用。

考虑到大鼠对水合氯醛及戊巴比妥等药物的耐受窗口较窄，我们的实验注射剂量已经很大，如果再对大鼠进行麻醉或镇静容易诱导它们死亡，加之大鼠本身性情较温顺，所以我们采取直接抓取固定有活力的大鼠进行裂隙灯拍照观察及记录，避免了因麻醉导致的死亡，极大地降低了死亡率。但是本次研究还存在一些不足，由于这次研究的目的主要是观察腹腔注射半乳糖是否能成功诱发白内障形成，故我们当时的目的只局限于是否能成功诱发白内障，疏忽了对血糖的监测，在以后进一步的实验研究中，我们会进一步完善我们的实验方案。另外，由于我们本次的实验由2名助手轮流进行腹腔注射给药，A为有经验者，B为初学者，大鼠死亡的发生基本在B者注射给药时，此种给药途径，特别是高剂量已经基本等量于大鼠的腹腔容积，故我们认为，腹腔注射的方式和方法尤为重要，应避免注射时扎到腹腔脏器。但是，在有这个实验干扰因素的影响下，我们此次的研究较其他学者的研究降低了死亡率的基础上，还保证了较高的造模成功率，于是我们认为，我们的方法可以为日后需要对不同时期白内障进行实验研究的学者提供一个参考方案。