前列腺癌是全球第二常见的男性恶性肿瘤[1]。虽然前列腺癌可以早期诊断及治疗，但仍然是全世界男性癌症死亡的第六大原因[2]。目前，针对前列腺癌治疗的方式主要有手术切除、放射治疗、内分泌治疗等几大类[3]。然而，大多数前列腺癌在去势手术治疗后2年内最终将转化为去势抵抗型前列腺癌，亦称为难治性前列腺癌(CRPC)。近年来，许多研究者提出了“前列腺肿瘤干细胞(PCSC) ”的概念，认为这可能是前列腺癌的细胞起源，并在前列腺癌的发生、发展、转移、复发、去势抵抗及耐药等多个方面发挥作用[4]。肿瘤干细胞是肿瘤组织中具有无限自我更新能力并能产生肿瘤异质性的细胞，其特性还包括具有分化潜能、高致瘤性等[5]。有研究发现，从前列腺移植瘤中获取的CD44+细胞具有干细胞特性。CD44是一种细胞表面分子，在细胞黏附、信号转导、肿瘤迁移进展等多方面有重要作用，也被公认为是细胞具有干性倾向的分子标志。本研究选取人前列腺癌DU-145细胞进行无血清连续传代培养，从而富集、分离肿瘤干细胞并鉴定其特性，以期利用一种简单、快捷、有效的方法实现前列腺肿瘤干细胞的制备，为后续更多针对前列腺癌干细胞靶向治疗的研究奠定基础。
材料与方法 一、材料人前列腺癌LNCaP、DU-145细胞株购自中国科学院上海细胞库。胎牛血清、RPMI 1640培养基、DMEM/F12细胞培养基、磷酸盐缓冲液(PBS)购自美国Gibco公司。青霉素链霉素混合液、0.05%胰酶(含EDTA)、牛血清白蛋白(BSA)、胰岛素、B27购自美国Sigma公司。人重组表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(bFGF)购于美国PeproTech公司。胰酶抑制剂购自索莱宝公司。超低黏附6孔培养板购自美国Corning公司。异硫氰酸荧光素(FITC)标记的鼠抗人CD44抗体及其同型抗体(IgG2b)、流式细胞仪购自美国BD公司。CCK8增殖检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。550型酶标仪购自美国Bio-rad公司。4~6周龄的NOD-SCID雄性裸鼠，体质量18~20 g，购自北京维通利华公司，饲养于中山大学北校区动物实验中心SPF级动物房，实验遵循动物伦理要求。
二、方法 1. 细胞培养及传代将RPMI-1640培养基加入10%胎牛血清和1%青霉素链霉素混合液制备成含血清培养基(SSM)。将体积分数2% B27、0.4%BSA、5 μg/ml胰岛素、10 ng/ml bFGF、20 ng/ml EGF加入DMEM/F12培养基制备成无血清培养基(SFM)。DU-145细胞在SSM中培养时，每2 d进行细胞换液或传代；在SFM中培养时，每日观察悬浮细胞生长情况并轻摇晃培养瓶避免细胞贴壁，每3 d进行细胞换液，每7 d进行细胞传代。细胞传代时，弃旧培养基，加入1 ml胰酶共孵育2 min后，加入2 ml胰酶抑制剂(或SSM)终止消化，后继续按1: 2的比例传代培养，每日观察细胞生长情况。
2. LNCaP、DU-145细胞中CD44+表达情况的检测取经SSM培养至对数生长期的LNCaP细胞和DU-145细胞，分别以1×106个重悬于100 μl PBS溶液中，2种细胞各制备3管，分别为空白管、同型对照管(含1 μl IgG2b)、FITC-CD44抗体管(含1 μl FITC-Anti CD44)避光4 ℃反应15 min后，加入1 ml PBS，1 000转/分离心3 min，轻倒掉上清液后加入400 μl PBS重悬细胞，利用流式细胞仪检测CD44+细胞比例。
3. DU-145细胞无血清传代培养富集肿瘤干细胞及成球率的计算取经SSM培养至对数生长期的DU-145细胞，经40 μm孔径细胞筛滤过，用PBS离心清洗1次以去除血清后，以3×104个/孔重新铺板于超低黏附6孔板中，加入SFM继续在37℃、5%CO2培养箱中培养14 d。每日摇晃1次培养板避免细胞贴壁，每3 d换1次液，分别于第20 h、2 d、7 d、14 d在倒置相差显微镜下动态观察。以形态立体、肿瘤细胞微球直径＞60 μm定义为成球，连续计数5个视野取平均值计算成球率。成球率=该视野内成球细胞个数/该视野内总细胞个数×100%。
4. SSM和SFM中检测DU-145肿瘤微球细胞的分化能力将连续在SFM中培养14 d后的DU-145肿瘤微球细胞用胰酶消化分离后，用SSM终止反应，1 000转/分离心3 min后弃上清液，加入新鲜SSM重悬细胞，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，动态观察并记录细胞形态变化情况。收集细胞，再次用500 μl胰酶消化3 min后用1 ml胰酶抑制剂终止反应，离心后，用新鲜SFM重悬细胞并动态观察记录细胞形态变化情况。
5. DU-145肿瘤微球细胞的体外增殖能力检测分别将DU-145细胞、DU-145肿瘤微球细胞制备成单细胞悬液，以103个/100 μl的密度在96孔板中各接种3孔，使用SSM、37 ℃、5%CO2培养箱中培养，每块板设置3个含100 μl SSM但不含细胞的的空白孔，以后每隔2 d换液1次。第1~8日，每日于同一时间给一块板加入10 μl CCK-8工作液后与细胞避光继续在37 ℃、5%CO2培养箱内培养1.5 h后，利用酶标仪测定450 nm处吸光度(OD450)，并绘制细胞增殖曲线。
6. 检测DU-145肿瘤微球细胞在免疫缺陷裸鼠体内的成瘤情况DU-145细胞(6.5×105/100 μl)、DU-145肿瘤微球细胞(6.5×104/100 μl)分别消化、离心后以PBS重悬为上述密度单细胞悬液。将6只雄性NOD-SCID裸鼠称重后随机分为2组，每组3只。每只裸鼠注射100 μl细胞悬液和100 μl基质胶混合液于左后腿根部皮下，动态观察2组裸鼠的成瘤情况，待肉眼可见肿瘤后，每5 d用游标卡尺测量肿瘤的长径和短径，计算肿瘤体积。肿瘤体积= (π×长径×短径2/6) mm3，35 d后处死裸鼠，并绘制肿瘤生长曲线。
三、统计学处理应用SPSS 13.0处理数据。计量资料以x±s表示，组间比较采用独立样本t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
结果 一、LNCaP细胞、DU-145细胞中CD44+细胞比例比较CD44+ LNCaP细胞、CD44+ DU-145细胞比例分别为0.4%、97.6%，见图 1。CD44+ DU-145细胞比例约为CD44+ LNCaP细胞的271倍。
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图 1 LNCaP细胞、DU-145细胞中CD44+细胞流式细胞仪检测结果 A、B：LNCaP细胞；C、D：DU-145细胞 |
DU-145细胞具有干细特征的部分可以在无血清培养基中生存并逐渐形成悬浮细胞球：悬浮培养20 h时，单个细胞开始出芽，但尚未形成立体形态；悬浮培养第2日可观察到一小部分细胞表现出成球团的趋势，成球率为(14.4±7.8) %；第7日可观察到形态立体、典型的悬浮球形成，成球率为(34.2±8.7) %；悬浮培养第14日，成球率明显较第7日增加，满视野内可观察到立体形态的悬浮球，成球率为(61.4±7.6) %。并且DU-145肿瘤微球细胞在经过无血清悬浮培养传代后，仍可形成与原细胞形态类似的次代并逐渐形成悬浮肿瘤微球细胞，见图 2。
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图 2 不同时间点悬浮培养DU-145细胞肿瘤微球细胞形成情况(×100) A：悬浮培养20 h时，单个细胞开始出芽，但尚未形成立体形态；B：悬浮培养第2日，可观察到一小部分细胞表现出成球团的趋势；C：悬浮培养第7日，可观察到形态立体、典型的悬浮球形成；D：悬浮培养第14日，满视野内可观察到立体形态的悬浮球；标尺=60 μm |
将无血清悬浮培养的DU-145肿瘤微球细胞转入含10%胎牛血清中培养10 h，已能观察到细胞贴壁，24 h后其伸出伪足逐渐形成单层贴壁细胞，形态与常规贴壁培养DU-145相近，见图 3。再次将其转入无血清悬浮培养，仍能在20 h后观察到单个细胞开始出芽，形成一些悬浮细胞团，继续培养至第5日，可观察到典型肿瘤细胞球形成。
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图 3 DU-145肿瘤微球细胞、DU-145细胞在SMM中培养2 d的形态对比(×100) A：DU-145肿瘤微球细胞；B: DU-145细胞 |
DU-145肿瘤微球细胞与普通DU-145细胞在铺板后第2日的OD450分别为0.757±0.059、0.373±0.068，DU-145肿瘤微球细胞增殖能力达到普通DU-145细胞2倍左右(t=7.382，P＜0.05)。从第6日开始，两者皆进入生长平台期。到第8日，DU-145肿瘤微球细胞与普通DU-145细胞的OD450分别为0.228±0.063、0.086±0.036，DU-145肿瘤微球细胞存活量仍高于DU-145细胞(t=3.373, P＜0.05)，见图 4。
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图 4 DU-145细胞与DU-145肿瘤微球细胞的体外增殖能力比较 |
DU-145细胞组种植细胞的数量级是DU-145肿瘤微球细胞组的10倍，但在移植瘤细胞接种裸鼠后第10日，DU-145细胞组仅2只裸鼠可见皮下成瘤，瘤体体积(8.4±1.2) mm3，成瘤率2/3，而DU-145肿瘤微球细胞组3只裸鼠均可见皮下肿瘤形成，瘤体体积(28.1±5.9) mm3，成瘤率为3/3，DU-145肿瘤微球细胞组在第10日的瘤体体积大于DU-145细胞组(t=4.464，P＜0.05)。接种后第30~35日为移植瘤快速生长期，DU-145细胞组生长速度为(69.2±20.1) mm3/d，DU-145肿瘤微球细胞组为(376.3±45.1) mm3/d，DU-145肿瘤微球细胞组生长速度达到DU-145细胞组的5倍(t=8.709，P＜0.05)，见图 5A。DU-145细胞与DU-145肿瘤微球细胞移植瘤在裸鼠体内生长35 d后活体情况见图 5B、C。
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图 5 DU-145细胞与DU-145肿瘤微球细胞的体内致瘤能力比较 A：接种DU-145细胞与DU-145肿瘤微球细胞在免疫缺陷裸鼠体内的移植瘤体积增长曲线；B：DU-145细胞在免疫缺陷裸鼠体内35 d生长情况，红色箭头为裸鼠皮下成瘤处；C：DU-145肿瘤微球细胞在免疫缺陷裸鼠体内35 d生长情况 |
近年来，研究者们已在多种肿瘤中分离并证实存在肿瘤干细胞[6-7]。在既往关于前列腺癌治疗的相关报道中，基本是以前列腺癌细胞系为研究对象进行体内外研究。然而越来越多的研究表明，前列腺肿瘤干细胞才是前列腺癌发生、发展的根源。为此，本研究通过简单易行的无血清连续传代培养法富集、分离前列腺肿瘤干细胞，并证明了其肿瘤干细胞相关特性，以期为针对前列腺肿瘤干细胞的诊断及治疗研究奠定基础。虽然，免疫磁珠分选法和流式分选法也是为研究者们所熟知的分选、富集肿瘤干细胞的另外2种常见方法。但是，这2种方法相较于本研究所使用的无血清连续传代培养法，对科研设备要求更高，费用也较为昂贵，例如利用免疫磁珠法分选CD44+ DU-145细胞需要合适的磁场，以及同时制备大量的DU-145细胞(108数量级)进行分选，对研究实验要求较高[8]。若利用流式分选法进行CD44+ DU-145细胞分选，由于流式细胞仪分选通道较长易造成细胞污染，且分选步骤复杂容易损伤细胞活性，分选得到的细胞难以用于后续实验[9]。
虽然既往研究显示，CD44分子仍表达于结肠癌、头颈部鳞癌、胃癌、膀胱癌、神经胶质瘤、鼻咽癌等肿瘤细胞[10-11]。但本研究选用的是CD44+人前列腺癌DU-145细胞系，研究对象为前列腺癌，并通过无血清连续传代培养的方式富集得到了具有干性特征的前列腺肿瘤细胞。因此，这与CD44不仅表达在前列腺肿瘤干细胞的特性并不冲突。
研究发现，在人前列腺癌细胞株如LNCaP、DU145及PC-3中，CD44+细胞比CD44－细胞有更强的增殖及成瘤的能力。Ugolkov等[12]指出，在前列腺癌组织中CD44+细胞约占72%，这一发现颠覆了以往干细胞仅占据组织细胞很小比例的认识。本研究中，流式细胞仪检测结果示DU-145细胞系中CD44+细胞约占97.6%，与Ugolkov等的观点相符。
综上所述，本研究通过对DU-145细胞系连续传代无血清培养富集、分离得到了具有干性特征的肿瘤细胞。这对于肿瘤干细胞这一类较难获取细胞具有重要意义。同时，本研究也对前列腺癌治疗的相关研究，特别是对去势难治性前列腺癌的治疗提供了一种新的靶向治疗思路，即针对前列腺肿瘤干细胞进行靶向治疗，从根源上治疗前列腺癌。针对前列腺肿瘤干细胞的研究极具前景，本研究团队将以此研究为基础，今后继续开展针对前列腺肿瘤干细胞靶向诊断及治疗的相关研究，进而为前列腺癌的基础研究提供一定的支持或参考。
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