肺动脉高压(PAH)是一种严重的进展性疾病，其主要病理生理特征为肺内小血管管腔缩窄、重构导致肺血管阻力进行性增高，甚至右心衰竭和死亡[1-2]。PAH的发病与多种因素有关，至今仍未完全阐明[1-2]。近年多项研究显示，PAH的发病可能与多种炎症因子有关[3]。野百合碱是一种生物碱，由于其诱导产生的PAH与人类特发性PAH最为接近而被广泛应用于建立PAH的动物模型[4]。本研究将在野百合碱诱导的大鼠PAH模型中观察TGF-β1和IL-6表达情况，并探讨其意义。
材料与方法 一、实验动物和材料本实验所用的雄性SD大鼠(7周龄，体质量220~250 g)由中山大学实验动物中心提供，并饲养于该中心SPF级动物房。饲养环境为恒温(22±2)℃，恒湿(55±5)%，每日照明12 h，自由饮水、进食。野百合碱购自美国Sigma公司；TGF-β1和GAPDH抗体购自美国CST公司；IL-6 ELISA试剂盒购自美国Abcam公司。本动物实验经中山大学实验动物伦理委员会批准，并根据中山大学动物实验中心的实验动物操作标准进行。
二、动物分组和建立模型使用随机数字表法将22只雄性SD大鼠分为3组：正常对照组(n=6)、野百合碱-3周组(MCT-3w组，n=8)和野百合碱-5周组(MCT-5w组，n=8)。其中，MCT-3w组和MCT-5w组大鼠分组后一次性经腹部皮下注射野百合碱60 mg/kg建立PAH模型，正常对照组皮下注射生理盐水60 mg/kg作对照。MCT-3w组在野百合碱注射3周后到达实验终点，MCT-5w组和正常对照组在野百合碱注射5周后到达实验终点。
三、右心室收缩压(RVSP)和右心室肥厚指数(RVHI)的测定大鼠称重后，腹腔内注射戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉，并将大鼠固定于小动物手术台，游离出右侧颈外静脉，远心端用手术线结扎，显微手术剪剪开颈外静脉1/3，将已充盈肝素钠的聚乙烯导管(PE-100)从右颈外静脉插入，经上腔静脉、右心房插入右心室，导管连接换能器，通过PowerLab生物信号采集系统，待波形稳定后记录RVSP。处死大鼠后分离大鼠心脏，剪去左、右心房及大血管根部，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗干净后将心室剪为右心室游离壁(RV)和左心室加室间隔(LV+S)2部分，分析天平称重后计算两者的比值即为右心室肥厚指数[RVHI= RV/(LV+S)]。
四、肺小动脉形态学观察游离出大鼠肺脏，4 ℃ PBS反复冲洗，右肺组织经液氮冷冻后迅速转至-80℃冰箱冻存备用。剪取左下肺组织(厚度约0.5 cm)，PBS冲洗干净后放入4%多聚甲醛中固定12 h，分别经50%、75%、95%、100%乙醇脱水、浸蜡、包埋，切片行van Geison染色，在光学显微镜下观察肺内小动脉的病理改变，先在低倍镜下挑选，然后在高倍镜下选择直径在50~100 μm的肺小动脉拍照并分析。每张切片选取15~20根肺小动脉，运用图像分析软件分别测量肺内小动脉的血管壁厚度(WT)、血管直径(ED)，并计算血管壁厚度占血管直径的百分比(WT%)、肺内小动脉的环形血管壁面积(LA)占小动脉总横截面积(TA)的百分比(WA%)。WT%和WA%按以下公式计算：WT(%)=2×WT/ED×100%；WA(%)=(TA-LA)/TA×100%。
五、肺组织中TGF-β1表达水平检测取约50 mg右肺组织，加入400 μl组织蛋白裂解液，在研磨器中充分研磨、4 ℃静置30 min，4℃ 12 000转/分高速离心后提取总蛋白质。测定蛋白浓度后，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法将等量蛋白质进行分离并转移至PVDF膜上，用含10 g/L小牛血清白蛋白的TBS-T溶液封闭2 h后，分别加入抗TGF-β1和GAPDH抗体(1:1 000)，4 ℃孵育过夜。TBS-T溶液洗涤后加入二抗稀释液(1:8 000)，轻轻摇动2 h后用TBS-T洗膜4次，最后用化学底物进行发光显迹。用IBAS图像处理系统对胶片进行扫描后应用Image图像分析软件分析各条带的灰度值进行比较。
六、肺组织中IL-6表达水平检测取约100 mg右肺组织加冰生理盐水1 ml制成100 g/L组织匀浆，用ELISA检测肺组织中IL-6表达水平。
七、统计学处理使用SPSS 19.0分析数据。计量资料以x±s表示，组间比较采用方差分析，多重比较采用LSD-t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
结果 一、各组大鼠的RVSP和RVHI比较到达实验终点时，MCT-3w组和MCT-5w组分别有1只和2只大鼠死亡，正常对照组无大鼠死亡。与正常对照组相比，MCT-3w组大鼠的RVSP和RVHI均升高(P均 < 0.05)，表明PAH模型建立成功，而与MCT-3w组相比，MCT-5w组大鼠的RVSP和RVHI进一步升高(P均 < 0.05)，见表 1。
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表 1 各组大鼠的RVSP和RVHI的比较(x±s) |
3组的WT%和WA%比较差异均有统计学意义(F值分别为25.076和37.883，P均 < 0.001)。与正常对照组相比，MCT-3w组大鼠的肺小动脉中膜增厚，WT%和WA%增加，而与MCT-3w组相比，MCT-5w组大鼠的肺小动脉中膜进一步增厚，WT%和WA%增加(P均 < 0.05)，见图 1。
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图 1 各组大鼠肺内小动脉的形态变化(van Geison染色，×400) A：正常对照组；B：MCT-3w组；C：MCT-5w组；D：各组WT%和WA%的比较；与正常对照组相比，*P < 0.05；与MCT-3w组相比，#P < 0.05 |
3组的TGF-β1表达水平比较差异具有统计学意义(F=128.935，P < 0.001)。与对照组相比，MCT-3w组大鼠肺组织中TGF-β1的表达上调，而MCT-5w组大鼠肺组织中TGF-β1表达比MCT-3w组进一步增加(P＜0.05)，见图 2。
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图 2 TGF-β1在各组大鼠肺组织表达水平比较 A：蛋白免疫印迹法检测结果；B：扫描后光密度比值的比较；与正常对照组相比，*P < 0.05；与MCT-3w组相比，#P < 0.05 |
正常对照组、MCT-3w组、MCT-5w组大鼠肺组织上清液的IL-6表达水平分别为(4.9±1.4)、(11.9±1.8)、(20.8±2.1)ng/L，3组的IL-6表达水平比较差异有统计学意义(F=78.864，P < 0.001)。与对照组相比，MCT-3w组大鼠肺组织中IL-6表达水平增加(P < 0.05)，而MCT-5w组大鼠肺组织中IL-6表达水平比MCT-3w组进一步增加(P＜0.05)，见图 3。
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图 3 IL-6在各组大鼠肺组织的表达情况 与正常对照组相比，*P < 0.05；与MCT-3w组相比，#P < 0.05 |
野百合碱是一种生物碱，本身并无生物学活性，但其在体内经肝脏代谢后生成有活性的吡咯野百合碱，可使肺血管内皮细胞损伤、血管平滑肌异常增殖，从而导致血管重构和PAH[4]。本研究中，MCT-3w组和MCT-5w组大鼠与正常对照组相比，RVSP和RVHI均增高、肺小动脉中膜增厚，表明本研究的PAH模型已建立成功。TGF-β1和IL-6在MCT-3w组和MCT-5w组肺组织中的表达水平均升高，而且在MCT-5w组中升高更明显，提示TGF-β1和IL-6可能参与PAH的发病，而且TGF-β1和IL-6的表达水平与PAH的进展可能相关。
TGF-β1是一种多功能细胞活性调节因子，可通过各种受体和细胞外信号分子参与细胞的增殖、迁移和分化等活动[5]。越来越多的证据表明，TGF-β1信号通路异常与PAH的发病机制有关[6]。TGF-β1可通过调控多种信号通路抑制内皮细胞的凋亡、促进血管平滑肌细胞异常增殖、增加细胞外基质沉积等过程，从而促进PAH的形成和发展[7-8]。相反，通过抑制TGF-β1及其下游信号分子的表达，可减缓血管平滑肌细胞的异常增殖、减少细胞外基质的沉积[9]。本研究进一步证实，随着疾病的进展和肺动脉压力的进一步增高，TGF-β1在肺组织中的表达也增多。由此可见，TGF-β1在PAH发生和发展中有重要作用，TGF-β1有望成为PAH治疗的新靶点。
IL-6是由活化的T细胞和成纤维细胞产生的细胞因子，可通过介导炎症、促进血管平滑肌细胞增殖等机制在PAH发病中发挥重要作用[10-11]。有研究者发现，在特发性PAH患者血清和肺组织中IL-6的表达增加[12]。本研究证实在野百合碱诱导的大鼠肺组织IL-6水平显著增加，而且随着病程进展，IL-6水平进一步增加。因此推测，IL-6可能参与了PAH的发病及进展，通过降低肺组织IL-6的浓度可能会降低肺动脉的压力，阻止PAH的进展。
综上所述，在野百合碱诱导的PAH模型中，大鼠肺组织中TGF-β1和IL-6表达水平升高，TGF-β1和IL-6可能参与PAH的发生和进展，有望成为PAH的治疗靶点。
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