β-地中海贫血(β-地贫, MIM 613985)是由于β-珠蛋白基因突变导致β-珠蛋白肽链合成量减少或完全不合成而引起的慢性溶血性贫血，是我国南方常见的危害人民健康的单基因遗传病之一[1]。β-地贫通常被认为是一种常染色体隐性遗传性疾病，因为患者只有同时获得2个突变等位基因(突变的纯合子或双重杂合子)而造成β-珠蛋白肽链合成量严重减少时才会出现明显的临床症状。显性遗传性β-地贫(dominantly inherited β-thalassaemia)是其中罕见的一种类型，通常是由于β-珠蛋白结构变异导致不稳定的异常血红蛋白沉积在细胞内引起的[2]。该病也曾被称为“包涵体性β-地贫”(inclusion body β-thalassaemia)，其表型多为严重程度不等的类中间型β-地贫[3]。自1973年该病的首个家系(爱尔兰)被报道以来，全世界已发现超过40种突变可引起显性遗传性β-地贫[4]。中国国内包括台湾地区，迄今为止仅有几篇关于中国人显性遗传性β-地贫的报道[5-7]。在本研究中，笔者对一个常染色体显性β-地贫家系进行了相关基因突变的分析，并复习了相关文献，现将结果报告如下。
对象与方法 一、1例表现为“贫血”的常染色体显性β-地贫患者及其家系成员临床资料的收集广州市番禺区何贤纪念医院于2012年4月诊治1例表现为“贫血”的常染色体显性β-地贫女性患者，收集并分析该例患者(先证者)及其家系成员的病史、体格检查、实验室及辅助检查、治疗等资料。
二、基因型及各项血液学参数的检测为了进一步明确病因，该例患者及其家系成员于2017年在中山大学中山医学院遗传教研室接受遗传学分析及相关检测。检测内容包括患者及其家系成员的基因型及各项血液学参数，包括α、β-珠蛋白基因、β-珠蛋白基因单倍型、血红蛋白F表达水平相关的主要SNPs的基因型和KLF1基因序列、血红蛋白组分、红细胞参数。本研究经患者及其家系成员知情同意，并经中山大学医学伦理委员会批准。
1. 基因组DNA的提取取患者及其家系成员的外周血2 ml，按常规酚、氯仿、异戊醇抽提法进行基因组DNA的提取。
2. 血红蛋白水平及红细胞参数采用全自动血液分析仪(XE-2100, Sysmex, Kobe, 日本)检测患者及家庭成员的血红蛋白水平及红细胞参数。
3. 血红蛋白组分分析采用Helena SPIFE 3000(Helena Laboratory, Beaumont, TX, 美国)检测患者及其家系成员的血红蛋白组分，包括血红蛋白A(α2β2)、血红蛋白A2(α2δ2)、血红蛋白F(α2γ2)和异常血红蛋白。
4. α、β-珠蛋白基因型分析中国人常见的α-地贫及β-地贫的基因检测按文献[8-9]进行。缺失型α-地贫的检测采用多重PCR方法；3种非缺失型α-地贫和17种点突变型β-地贫的检测采用PCR结合反向斑点杂交技术(RDB法)。α-地贫三体型(αααanti3.7和αααanti4.2)的检测按文献[10]进行。
5. β-珠蛋白单倍型分析β-珠蛋白单倍型分析采用基于PCR的限制型片段长度多态性(PCR-RFLP)技术和家系连锁分析方法。选择的7个经典RFLP位点分别为：Hinc Ⅱ-5′ε、Hind Ⅲ-Gγ、Hind Ⅲ-Aγ、Hinc Ⅱ-ψβ、Hinc Ⅱ-3′ψβ、Ava Ⅱ-β和Bam HI-3′β，引物序列参考文献[11]。
6. 血红蛋白F表达水平相关的主要SNPs的基因型和KLF1基因序列分析血红蛋白F表达水平相关的主要SNPs包括HBG2的rs7482144(XmmI)、HBS1L-MYB的rs9399137和BCL11A的rs766432位点，采用PCR扩增后直接测序的方法。KLF1基因的外显子、内含子、5′-UTR及3′-UTR的分析也采用PCR扩增后直接测序的方法[12]。
三、文献检索以“dominantly inherited beta-thalassemia”“HBB Unstable Hemoglobin” “Hb Dippie”“HBB c. 383A>G”和“beta-thalassemia codon 127”为检索词，在PubMed数据库进行检索；以“Entries involving the beta gene”为检索词，在人类血红蛋白变异和地中海贫血数据库(HbVar数据库，A database of Human Hemoglobin Variants and Thalassemias)进行检索；以“HBB”为检索词，在人类基因突变数据库(HGMD数据库2018.1版本，The Human Gene Mutation Database)进行检索；以“显性地中海贫血”“血红蛋白Dippie”在中国生物医学文献服务系统(SinoMed)、中国期刊全文数据库(CNKI)、万方数据知识服务系统和维普中文科技期刊数据库进行检索，分析检索到的携带血红蛋白Dippie突变的患者的资料。上述数据库检索的截止时间为2018年3月20日。
结果 一、1例表现为“贫血”的常染色体显性β-地贫患者及其家系成员的病例资料 1. 病史、实验室及辅助检查结果患者女，29岁，汉族，因“妊娠23周，贫血加重1周”于2012年4月19日入广州市番禺区何贤纪念医院治疗。患者长期有轻度贫血，于23岁第1次妊娠中期时贫血加重，但未接受输血，妊娠38周时行“剖宫产术”产下一2.4 kg的健康女婴。体格检查：体型偏瘦，发育正常，营养中等。皮肤苍白，未见皮疹及出血点。结膜苍白，巩膜轻度黄染，口唇苍白。心率104次/分，心律整齐，未闻及早搏音，心音有力，主动脉听诊区可闻及收缩期Ⅲ级吹风样杂音；脾位于左肋下9 cm，质地硬，边缘钝；肝右肋下、剑突下未触及。入院前1日门诊外周血检查显示：血红蛋白54 g/L，红细胞2.3×1012/L，平均血红蛋白含量(MCH)23.2 pg，平均红细胞体积(MCV)79.0 fl，红细胞分布宽度(RDW)24.4%, 网织红细胞百分比(RET %)8.2%，网织红细胞绝对值(RET #)176.3×109/L。血红蛋白组分分析显示：血红蛋白A 92.7 %、血红蛋白A2 3.9 %，血红蛋白F 3.3%；电泳未见异常血红蛋白条带；红细胞渗透脆性降低；促红细胞生成素高于200 mIu/ml；血清铁测定49.5 μmol/L，总铁结合力83.8 μmol/L，血清铁饱和度59.0%；总胆红素、直接胆红素和间接胆红素分别为57.1、16.8和40.3 μmol/L；维生素B12 < 150 pg/ml；叶酸2.9 ng/ml；促红细胞生成素>200 mIu/ml；葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)水平正常。外周血涂片提示：成熟红细胞大小不一，可见球形、椭圆形、泪滴型、嗜多色、嗜碱点彩和碎裂形红细胞。骨髓细胞检查提示：骨髓增生明显活跃，粒细胞与红细胞比值为1:7.1；红系增生显著，占88 %，以中晚幼红细胞增生为主。
2. 治疗患者入院后给予补充甲钴胺、叶酸，并输洗涤红细胞4.00 U，次日复查血红蛋白82 g/L；4月26日复查血红蛋白76 g/L，再次输洗涤红细胞4.00 U。血红蛋白电泳结果考虑β-地贫，但用于检测中国人常见α、β-地贫的检测方法无发现该例患者的任何异常。入院诊断：①贫血查因；②孕23周；③脾肿大查因。1周以后，患者自觉无头晕、乏力等不适，强烈要求出院，按自动出院办理。在妊娠第39周，患者于外院接受“剖宫产术”产下一2.7 kg健康男婴。
3. 再次入院及治疗过程2013年3月26日患者因“贫血加重3 d”再次入广州市番禺区何贤纪念医院治疗。入院3 d前患者自觉头晕，伴阵发性头痛，无胸闷、气促，无发热、畏寒，于我院门诊查血常规示血红蛋白83.0 g/L；肝功能示总胆红素、直接胆红素和间接胆红素分别为82.0、7.9和74.0 μmol/L；腹部CT示脾大。遂以“脾功能亢进、中度贫血”再收入院。入院后完善相关检查，无手术禁忌证，于3月27日行“部分脾动脉栓塞术”，术后患者恢复良好，病情稳定，准予出院，定期复查。
二、先证者家系成员的病例资料先证者的哥哥、母亲和外祖母也有贫血和脾肿大，但从未接受输血和手术；其外祖母，汉族，在75岁时由于交通事故去世；其儿子，轻度贫血，但肝脾未触及肿大；其女儿，无贫血及肝脾肿大。家系图谱见图 1。家系分析表明，该病的遗传方式可能为常染色体显性遗传。
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图 1 一个常染色体显性遗传性β-地贫家系图谱 |
表 1总结了该家系4例患者及1例正常对照的血液学数据。3例成年患者均符合类中间型β-地贫症状，包括中度贫血、黄疸、脾肿大和血红蛋白A2水平升高；Ⅳ:2，先证者5岁的儿子也出现轻度贫血和血红蛋白A2水平升高；Ⅳ:1，先证者11岁的女儿各项血液学表型正常。
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表 1 常染色体显性遗传性β-地贫先证者及其家系成员的血液学资料 |
用于检测中国人常见α、β-地贫的检测方法无发现该家系患者的任何异常，也无发现患者存在αααanti3.7和αααanti4.2。DNA序列测定显示，所有患者HBB基因第127密码子均发生杂合性突变(c.383A>G[beta127(H5)Gln>Arg])，见图 2。先证者表型正常的女儿IV:1，该位点为正常的c.383A纯合子。突变所在的β-珠蛋白单倍型显示，其与单倍型2[+-----+]连锁。该单倍型常见于中国南方地区的β-珠蛋白基因突变等位基因和正常等位基因中，这表明c.383A>G突变无明确的起源[13-14]。所有患者血红蛋白F表达水平相关的主要SNPs位点基因型均为HBG2 rs7482144 G/G(XmmI: -)、HBS1L-MYB rs9399137 T/T和BCL11A rs766432 A/A，这些基因型已被证明与中国人β-地贫杂合子的最低F细胞中位数或最低血红蛋白F水平相关[15-17]。在血红蛋白F和血红蛋白A2表达中发挥重要作用的KLF1基因未在患者中发现功能性变异[12-18]。
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图 2 常染色体显性遗传性β-地贫患者及正常人HBB基因第3外显子的部分测序结果对照 A：患者HBB基因c.383A>G杂合性突变；B：正常人HBB基因c.383A序列；箭头提示突变所在位点 |
检索文献后共收集到3篇文献报道了3例携带血红蛋白Dieppe杂合性突变的患者，其中仅1例法国籍患者具有较详细的表型资料，见表 2。
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表 2 携带血红蛋白Dieppe杂合性突变的病例的统计表 |
血红蛋白Dieppe突变由Girodon等[19]于1992年首次报道，该例患者为31岁法国女性，其表现为类中间型地贫症状，如慢性贫血(血红蛋白75 g/L)，偶尔需要输血，脾肿大和中度血色素沉着症，其血红蛋白A2含量正常(2.5%), 但血红蛋白F含量高达18.0%。由于在血红蛋白电泳中无发现异常血红蛋白带及异丙醇实验阴性，故该变异血红蛋白被认为高度不稳定。在本研究中，4例成年患者均出现类中间型地贫症状，这与法国患者的表型一致。但我们的患者血红蛋白A2水平较高(4.4%~5.5%)而血红蛋白F含量很低(< 3.3%)，这种与上述法国患者的差异原因不明，可能与不同的遗传背景有关。在本研究的患者中，血红蛋白F表达水平相关的主要SNPs位点均表现为与最低的F细胞中位数或血红蛋白F水平相关的基因型；在血红蛋白F和血红蛋白A2表达中发挥重要作用的KLF1基因，未在患者中发现功能性变异。这些基因型很可能可以解释我们患者的低血红蛋白F水平。
β127Gln位于β-珠蛋白肽链的α-螺旋的H段，与α-珠蛋白肽链的Arg B12、Ser B16和Val G14残基相互作用。血红蛋白Dieppe变异在β127位点引入1个带正电荷的亲水残基Arg，替代原来的极性中性残基Gln。该位点Arg到Gln的替换会造成αβ二聚体不稳定。变异的α2β2四聚体可以形成，但是带有胍基团的高度阳性的Arg β127 H5残基会强烈破坏α1β1的接触，导致蛋白过早水解。因此，蛋白合成之后，所有不稳定的血红蛋白迅速沉淀在骨髓红细胞前体的膜上，导致生成无效红细胞，这种病理生理机制引起显性类中间型地贫症状[19]。
除了血红蛋白Dieppe，已有另外5种位于127位密码子的突变被发现，包括3种错义突变血红蛋白Complutense(Gln Glu)、血红蛋白Brest(Gln Lys)和血红蛋白Houston(Gln Pro)，1种无义突变β127(Gln Stop)和血红蛋白Gunma突变(即3-bp缺失导致密码子127/128位Gln-Ala被脯氨酸替代)[21-24]。这些突变的临床表型差别很大，血红蛋白Complutense、血红蛋白Brest和血红蛋白Gunma只引起轻微的β-地贫症状，而其它突变则引起显性类中间型地贫症状。有趣的是，β127无义突变可引起临床表型异质性。即使在同一家庭中，有些患者有相当严重的类中间型地贫表型，出现症状2年后就必须行脾切除术，而具有相同的α、β-珠蛋白基因型的其他个体却无明显的临床症状[22]。在我们的研究中，先证者Ⅲ:2也比同一家庭中其他携带相同血红蛋白Dieppe成员的症状更严重，是他们中唯一行脾动脉栓塞术的个体。目前，对于不同突变或相同突变导致的表型异质性的机制还不是完全明了，其影响因素可能包括：突变珠蛋白的稳定性、αβ-珠蛋白二聚体形成的减少程度、个体间处理沉淀的珠蛋白肽链的蛋白水解酶活性的差异，以及不同的遗传背景等[19]。
本研究提示，对于一些具有类中间型地贫症状、但常规检测α、β-地贫的方法却没有发现任何异常的患者，应考虑患者可能携带少见或罕见的珠蛋白基因突变；若家系分析符合常染色体显性遗传方式，应考虑显性遗传性β-地贫的可能。β-珠蛋白基因的序列测定有助于发现这些少见或罕见的突变，从而有利于患者的个性化医疗和遗传咨询。
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