血管性认知功能障碍是血管或血管相关因素引起的认知功能障碍，与血管性炎症性损伤密切相关，常发生于麻醉和(或)手术后^[1-2]。高龄患者耐受麻醉和手术的能力低，而且随着肝、肾功能的减退，药物在其体内消除的半衰期也延长。七氟醚对心率影响不明显、气道刺激小，为临床常用麻醉药物。有学者认为，七氟醚能激活线粒体中的相关信号通路，减少炎性因子的生成，从而缓解术后脑损伤^[3]。然而，4%七氟醚吸入诱导约2 min患者意识即可消失，麻醉过深时有诱发全身痉挛的可能。目前有关七氟醚用于血管性认知功能障碍的效果尚有争议，因此本研究着重探讨七氟醚对老年血管性认知功能障碍大鼠认知功能的影响及其作用机制，现报告如下。

60只6月龄雌性Wistar大鼠，体质量250~300 g，购自中科院上海实验动物中心，饲养于SPF级动物房，本研究对实验动物的处置均符合中华人民共和国科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》。

七氟醚购自江苏恩华制药有限公司，血管内皮生长因子(VEGF)、IL-1β和TNF-α检测试剂盒购自南京碧云天公司，戊巴比妥钠和伊文思蓝购自北京雷根生物公司，原位末端脱氧核苷酸转移酶标记(TUNEL)试剂盒购自北京雷根生物公司；贝克曼库尔特Cyto FLEX流式细胞仪。

60只大鼠按随机数字表法分为A、B、C组，每组各20只。A组大鼠为假手术组；B组大鼠为血管性认知功能障碍模型，实施右侧颈动脉结扎术，结扎时间为1 h；C组大鼠实施右侧颈动脉结扎术后吸入2%七氟醚(每日2 h，共计5 d)^[4]。

穿梭箱试验：成功造模3 d后实施，穿梭箱规格为60 cm×16 cm×25 cm。将大鼠置于穿梭箱中20 s后，开启蜂鸣器，5 s后给予30 V 50 Hz电击，总电击时间为1 min，统计电击和主动逃避的次数。每只实验大鼠重复3次测试，结果取平均值。

水迷宫试验：穿梭箱试验3 d后实施，第1~3日进行定位航行训练，第4日以大鼠寻找并爬上平台的时间为逃避潜伏期；第8日进行空间探索实验，以在原平台Ⅰ象限游泳时间即空间探索时间为记忆潜伏期。

水迷宫试验完成后，经大鼠腹腔注射2%戊巴比妥(50 mg/kg)进行麻醉，取尾静脉血后断头处死，夹闭腹主动脉，灌注4 ℃ 4%多聚甲醛，速度先快后慢，共30 min，至右耳流出液体血色较浅且基本澄清为止，冰上分离脑组织，剥离双侧海马。

每组取8只大鼠的海马组织浸入4%的多聚甲醛溶液中，置4 ℃固定24 h，采用TUNEL染色，于显微镜下观察海马神经元细胞的凋亡情况：每张海马切片随机选择5个互相不重叠的视野，并选择400倍荧光显微镜下观察，阳性凋亡细胞的细胞核呈绿色颗粒状，计算凋亡指数，凋亡指数＝阳性细胞数/(阳性细胞数+阴性细胞数)×100%。

每组各取6只大鼠的海马组织制作组织匀浆，2 000~3 000转/分离心20 min，收集上清，应用流式细胞仪检测，以荧光指数反映胞浆钙离子水平。

20只大鼠的尾静脉血加入10% 0.1 mol/L柠檬酸钠混合10~20 min后，2 000~3 000转/分离心20 min，收集上清，应用ELISA检测大鼠血清中TNF-α、IL-1β和VEGF水平。每组取6只大鼠的海马组织剪碎后加入DMEM培养基制成单细胞悬液，以ELISA检测海马神经元中TNF-α、IL-1β、VEGF和线粒体呼吸链复合物Ⅰ~Ⅳ水平。

使用SPSS 21.0处理数据。计量资料均先行正态性检验，符合正态分布者以x±s表示，多组比较用方差分析，组间两两比较使用LSD-t检验；老龄大鼠血清炎性因子水平与认知功能的关系采用Pearson相关性分析。P < 0.05为差异有统计学意义。

B、C组大鼠的电击次数均多于A组，主动逃避次数均少于A组(P均 < 0.01)；而C组大鼠电击次数较B组减少，主动逃避次数较B组增多(P均 < 0.01)，见表 1。

表 1

表 1 3组老龄大鼠的穿梭箱试验结果比较(x±s) 次/分 组别 n 电击 主动逃避 A组 20 55.4±8.1 85.6±8.1 B组 20 92.2±8.3a 51.7±6.8a C组 20 72.2±7.1ab 72.0±5.1ab F值 110.133 126.669 P值 < 0.001 < 0.001 注：与A组比较，aP < 0.01；与B组比较，bP < 0.01

表 1 3组老龄大鼠的穿梭箱试验结果比较(x±s)

B、C组大鼠的学习和记忆潜伏期均较A组延长(P均 < 0.05)，其中C组大鼠的学习和记忆潜伏期短于B组(P均 < 0.05)，见表 2。

表 2

表 2 3组老龄大鼠的水迷宫试验结果比较(x±s) s 组别 n 学习潜伏期 记忆潜伏期 A组 20 64.1±5.1 60.2±4.3 B组 20 177.6±3.5a 153.4±11.7a C组 20 141.3±7.1ab 122.3±6.8ab F值 2 273.574 670.066 P值 < 0.001 < 0.001 注：与A组比较，aP < 0.15；与B组比较，bP < 0.01

表 2 3组老龄大鼠的水迷宫试验结果比较(x±s)

大鼠海马组织中，B、C组的VEGF水平低于A组，IL-1β和TNF-α水平高于A组(P均 < 0.05)；与B组比较，C组VEGF水平较高、IL-1β和TNF-α水平较低(P均 < 0.05)，见表 3。

表 3

表 3 3组老龄大鼠海马组织中炎性因子水平比较(x±s) pg/L 组别 n VEGF IL-1β TNF-α A组 6 89.5±7.1 16.8±5.1 18.2±6.0 B组 6 59.5±6.3a 31.5±4.2a 38.4±5.1a C组 6 79.3±5.8ab 23.8±3.8ab 24.5±6.7ab F值 33.871 16.752 25.151 P值 < 0.001 < 0.001 < 0.001 注：与A组比较，aP < 0.05；与B组比较，bP < 0.05

表 3 3组老龄大鼠海马组织中炎性因子水平比较(x±s)

B、C组大鼠血清VEGF水平低于A组，IL-1β和TNF-α水平高于A组(P均 < 0.05)；与B组比较，C组VEGF水平较高，IL-1β和TNF-α水平较低(P均 < 0.05)，见表 4。

表 4

表 4 3组老龄大鼠血清炎性因子水平比较(x±s) pg/L 组别 n VEGF IL-1β TNF-α A组 20 87.3±5.4 15.2±4.1 16.7±5.3 B组 20 55.5±4.6a 27.5±4.2a 34.5±4.7a C组 20 79.6±5.1ab 22.3±3.2ab 22.3±4.6ab F值 216.342 51.183 69.672 P值 < 0.001 < 0.001 < 0.001 注：与A组比较，aP < 0.05；与B组比较，bP < 0.05

表 4 3组老龄大鼠血清炎性因子水平比较(x±s)

大鼠血清VEGF水平与电击次数、学习潜伏期、记忆潜伏期均呈负相关，与主动逃避次数呈正相关(P均 < 0.05)。IL-1β水平和TNF-α水平与电击次数、学习潜伏期、记忆潜伏期均呈正相关，与主动逃避次数均呈负相关(P均 < 0.05)。

表 5

表 5 3组老龄大鼠血清炎性因子水平与认知功能的相关性分析 项目 VEGF IL-1β TNF-α r值 P值 r值 P值 r值 P值 电击次数 -0.314 0.028 0.417 0.009 0.381 0.013 主动逃避次数 0.411 0.009 -0.505 0.003 -0.417 0.009 学习潜伏期 -0.381 0.013 0.455 0.005 0.355 0.017 记忆潜伏期 -0.310 0.044 0.428 0.008 0.321 0.030

表 5 3组老龄大鼠血清炎性因子水平与认知功能的相关性分析

A、B、C组大鼠海马神经元凋亡指数分别为(4.2±2.1)%、(16.3±3.8)%、(4.8±1.9)%，组间比较差异有统计学意义(F=49.692，P < 0.01)，其中A、C组的海马神经元凋亡指数均低于B组(P < 0.01)，A、C组间比较差异无统计学意义(P>0.05)，见图 1。

图 1

图 1 荧光显微镜下3组老龄大鼠的海马神经元凋亡细胞图(TUNEL染色，×400) A：A组；B：B组；C：C组；箭头所示为凋亡细胞

A、B、C组大鼠海马神经元细胞内钙离子荧光指数分别为5.2±2.1、9.4±2.9、5.7±2.2，组间比较差异有统计学意义(F=7.153，P=0.004)，其中A、C组海马神经元细胞内钙离子荧光指数均低于B组(P < 0.01)，A、C组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

B组大鼠海马中线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ活性低于A、C组(P均 < 0.05)，A、C组间线粒体呼吸链复合物活性基本一致(P均>0.05)，见表 6。

表 6

表 6 3组老龄大鼠海马中线粒体呼吸链复合物活性比较 组别 n Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ A组 6 5.9±2.5 15.9±3.7 22.8±5.5 144.1±18.2 B组 6 4.1±1.9ab 11.3±2.2ab 17.9±4.3 122.6±14.8 C组 6 5.9±2.7 15.8±3.9 22.5±5.3 146.1±18.8 F值 4.212 3.682 1.767 3.381 P值 0.035 0.049 0.204 0.061 注：与A组相比，aP < 0.05；与C组相比，bP < 0.05

表 6 3组老龄大鼠海马中线粒体呼吸链复合物活性比较

炎症反应是缺血性神经元损伤的主要机制，微血管损伤诱发的缺血-再灌注损伤的核心是炎症反应的活化，痴呆程度和炎症与脑血管损伤有着直接的联系，所以抑制炎症是治疗脑血管疾病的主要策略。TNF-α与IL-1β是脑缺血损伤炎症反应最早出现的细胞因子^[5-7]。脑室注射IL-1β抑制剂可改善大鼠空间学习能力的损害^[8]。TNF-α水平的上调与认知功能障碍有关^[9]。研究发现，麻醉药物能够抑制炎性细胞因子的过度产生，并能减轻由缺血诱发的神经元凋亡^[10-11]。VEGF能够促进血管的生长和侧支循环的建立，是脑缺血性损伤的血管修复因子。局灶脑缺血的动物实验显示，脑梗死后3 d是最活跃的血管增生期，并可见明显的VEGF表达，提示应激反应能够诱发VEGF表达的上调，促进神经元功能的恢复^[12-13]。本研究显示，与缺血、缺氧诱发认知功能障碍的模型大鼠相比，吸入七氟醚的认知功能障碍大鼠海马组织及外周血VEGF水平上升，TNF-α和IL-1β水平下降，穿梭箱试验中其电击次数较少、主动逃避次数较多，水迷宫试验中其学习和记忆潜伏期较短，提示七氟醚对改善缺血、缺氧诱发的认知功能障碍有一定的效果。

细胞凋亡是多阶段且并非同步发生的进程。急性脑血管病可导致机体产生大量的自由基，并导致细胞内发生钙超载，从而引发神经元细胞凋亡^[14]。多项研究显示，神经元缺血、缺氧后自由基明显增多，其能持续开放线粒体的渗透性转换孔，导致线粒体膜电位发生异常、细胞凋亡^[15]。研究表明，大鼠的学习和记忆能力下降，与细胞超微结构如线粒体的肿胀和功能障碍密切相关^[16]。另有研究显示，强应激会导致海马神经元的树突棘发生退缩乃至消失^[17]。七氟醚能够拮抗缺血诱发的海马神经元凋亡及减少神经元的钙超载状态^[18]。本研究中，经七氟醚干预的认知功能障碍大鼠海马组织神经元凋亡指数、钙离子荧光指数、线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ活性均低于缺血、缺氧诱发认知功能障碍的模型大鼠，与假手术大鼠相近，提示七氟醚能够缓解由于缺血、缺氧所诱发的线粒体功能失常，发挥神经元保护作用。

综上所述，七氟醚能够有效减轻缺血、缺氧诱发的认知功能障碍，该保护机制与提高VEGF水平、减少IL-1β和TNF-α释放、减轻炎症损伤有关。此外七氟醚还能够减轻海马神经元内炎性反应的程度，从而提高了线粒体内呼吸链酶复合物Ⅰ、Ⅱ活性，减轻了海马神经元细胞凋亡，改善认知功能障碍。